Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 ‘-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.
A caixa de guia C/D RNAs nucleolar pequenas (snoRNAs) cataleia 2 ‘-O-methylation do RNA nuclear ribosomal e pequeno. Entretanto, um grande número de snoRNA em eucariotas mais elevados pode promiscuo reconhecer outras espécies do RNA e 2 ‘-O-methylate alvos múltiplos. Aqui, nós fornecemos o guia passo-a-passo para a análise rápida e não-caro do site-specific 2 ‘-O-methylation usando um método bem estabelecido empregando o ADN curto oligonucleotídeos chamado dnazymes. Estes fragmentos do ADN contêm as seqüências catalíticas que Cleave o RNA em posições específicas do consenso, assim como os braços variáveis da homologia que direcionam DNAzyme a seus alvos do RNA. A atividade de dnazyme é inibida por 2-‘ o-methylation do nucleotide adjacente ao local do clivagem no RNA. Assim, os DNAzymes, limitados somente pelo consenso da seqüência clivada, são ferramentas perfeitas para a análise rápida do RNA 2 ‘-O-methylation mediado por snoRNA. Nós analisamos o snoRNA snR13-e O 2 ‘-O-methylation snR47-guiado do RNA ribosomal 25S em Saccharomyces cerevisiae para demonstrar a simplicidade da técnica e para fornecer um protocolo detalhado para o ensaio DNAzyme-dependente.
As modificações do RNA jogam papéis importantes na regulação da expressão gênica. RNA 2 ‘-O-metilação e pseudouridilation, que são guiados por caixa C/D e caixa H/Aca pequenas nucleolar RNAs (snoRNAs), respectivamente, protegem o RNA da degradação e estabilizam suas estruturas de ordem superior1,2,3 . Os alvos do SnoRNA foram identificados principalmente em RNAs ribosomal (rRNA) e em RNAs nucleares pequenas (snRNAs). Entretanto, em eukaryotes mais elevados, há potencial centenas de snoRNA sem funções atribuídas e alguns deles podem reconhecer RNAs Múltiplo1,4,5,6,7. Portanto, métodos que permitam a identificação e análise de modificações guiadas por snoRNA são ferramentas importantes para desvendar mecanismos que regem os processos celulares.
Uma caixa C/D snoRNA-guiada putativo 2 ‘-O-methylation site pode ser identificado bioinformaticamente e confirmado experimentalmente por muitas técnicas, incluindo RNase H-dirigido clivagem, ou local-específico e genoma-Wide métodos, que empregam transcrição reversa na abordagem de concentração de nucleotídeos baixos (dNTPs)8,9,10,11. Estas técnicas são muito sensíveis, mas também trabalhoso e caro, portanto, pode não ser adequado para o teste inicial ou rápido. Um dos métodos mais simples e de baixo custo para identificar sites de 2 ‘-O-metilação é a clivagem de RNA dependente de DNAzyme12. Os DNAzymes são moléculas de DNA curtas, únicas e catalisadas, capazes de clivagem endonucleolítica de RNA em posições específicas. Eles consistem em uma seqüência de núcleos conservadas e catalisadora ativa e 5 ‘ e 3 ‘ braços de ligação compostos de sequências variáveis projetadas para hibridizar por Watson-Crick base-emparelhamento para o alvo de RNA (Figura 1). Assim, os braços 5 ‘ e 3 ‘ entregam a seqüência catalítica ao local específico do RNA. A clivagem dependente de dnazyme é inibida por 2 ‘-o-methylation do nucleotide posicionado diretamente a montante do local de clivagem12,13. Isto faz dnazymes ferramentas muito práticas para a análise de locais putativo ou conhecidos do RNA 2 ‘-O-methylation.
Dois tipos de DNAzymes são usados para análises de modificações do RNA12. A sequência ativa de 10-23 DNAzyme (Figura 1a) consiste em 15 nucleotídeos (5 ‘ RGGCTAGCTACAACGA3 ‘) que formam um laço em torno do dinucleotídeo de Purina-PIRIMIDINA (Ry) de RNA direcionado e catalisam a clivagem entre esses dois nucleotídeos. O RNA Purina (R) não é base-emparelhado com o dnazyme e os 2 ‘-o-methylation presentes no dnazyme inibe a clivagem. Os braços de ligação de 10-23 dnazymes são geralmente 10-15 nucleotídeos longo. A segunda classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figura 1b) contém 14-nucleotídeo seqüência catalítica (5 ‘ TCCGAGCCGGACGA3 ‘). Nucleotides C2, c3 e g4 par com c9 g10 e g11 formando uma estrutura de loop de haste curta. 8-17 dnazymes Cleave RNA a montante de qualquer guanina que é imperfeitamente emparelhado com o primeiro timina da seqüência ativa dnazyme. O nucleotide do RNA a montante do guanina não é base-emparelhado com o dnazyme e seu 2 ‘-o-methylation prejudica o clivagem. 8-17 dnazymes exigem mais braços homologia de cerca de 20 nucleotídeos para direcionar dnazyme para sua seqüência específica.
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo para a análise de 2 ‘-O-methylation de rRNA em Saccharomyces cerevisiae usando 10-23 e 8-17 dnazyme-dependente aproximações12,13 (Figura 1C). Este protocolo pode facilmente ser adaptado para outros organismos e espécies do RNA e empregado para as análises rápidas, preliminares ou principais do RNA 2 ‘-O-methylation local-específico.
A digestão dependente de dnazyme pode ser usada como um método simples e rápido para analisar o RNA 2 ‘-O-methylation local-específico12,13. DNAzymes Cleave RNA se o nucleotídeo a montante do local de clivagem não é metilado. Em contraste com outras abordagens, incluindo a digestão dirigida por RNase H, degradação alcalina ou transcrição reversa em baixa concentração de nucleotídeos seguida de PCR quantitativo ou seqüenciamento8,10,11 ,16, a aproximação de dnazyme exige um oligonucleotide simples do ADN e uns reagentes básicos que estejam atuais em todo o laboratório molecular da biologia. Além disso, DNAzymes pode ser usado em uma maneira similar para analisar o pseudouridylation do RNA negociado pela caixa H/ACA snoRNA12, que os faz ferramentas versáteis em estudar alvos do snoRNA.
As abordagens dependentes de DNAzyme são limitadas apenas por sequências de consenso do site de clivagem17. 10-23 DNAzymes pode ser usado para analisar 2 ‘-O-metilação apenas na posição R do dinucleotídeo RY, enquanto 8-17 DNAzymes reconhecem a modificação do nucleotídeo localizado a montante da guanina. Como resultado, modificações como 2 ‘-o-metilação do primeiro nucleotídeo nos dinucleotídeos guanina-adenina (GA), adenina-adenina (AA), pirimidina-adenina (ya) e pirimidina-pirimidina (YY) não podem ser analisadas. Além disso, deve-se considerar a baixa eficiência da clivagem dependente de DNAzyme12 . Embora alguns DNAzymes cliquem RNA quase completamente (Figura 3B), muitos dnazymes apenas parcialmente digerem seus alvos (Figura 3B). A eficiência pode depender da seqüência em torno do site clivagem. Por exemplo, as regiões do RNA com trechos do mesmo nucleotide podem afetar o posicionamento correto da seqüência ativa de DNAzyme. Além disso, as regiões do RNA que formam a estrutura secundária forte podem re-hybridize e suprimir a ligação de DNAzyme à seqüência do alvo. Para superar essas questões, ciclos de aquecimento e resfriamento do 10-23 DNAzyme e seu substrato de RNA podem ser aplicados18.
Nós usamos a aproximação de DNAzyme para investigar 2 ‘-O-methylation do rRNA. Um pode igualmente usar esta técnica para analisar outras modificações do RNA, tais como N6methyladenosine19. O RNA ribossomal, devido a sua abundância, pode ser analisado pela electroforese e os produtos do clivagem podem ser visualizados a luz UV. Entretanto, isto não é aplicável para RNAs menos abundantes como RNAs da codificação do RNA polymerase II-generated (mRNA) e RNAs não-codificando (ncRNA). Estes RNAs não podem geralmente ser detectados diretamente pelo RNA que mancha em géis do Agarose ou do poliacrilamida. Em tais casos, a segmentação DNAzyme-dependente pode ser visualizada pela mancha do Norte, detectada indiretamente pelo PCR/PCR quantitativo ou ser analisada pelo PCR quantitativo com polymerases (por exemplo, ADN polymerase de KlenTaq) capaz de discriminar O RNA 2 ′-O-methylated de RNA unmethylated20,21.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Maya Wilson e a Aneika leney pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Henry Dale Fellowship financiado conjuntamente pelo Wellcome Trust e da sociedade real (200473/Z/16/Z).
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |