Análisis de alto rendimiento de datos de asignación óptica mediante electromap

1. Recopilación de datos de mapeo óptico Realizar mapeo óptico cardíaco utilizando uno de una amplia gama de modelos experimentales incluyendo corazones enteros intactos y aislados6,18, aislamiento de la ría14,19, cuñas ventriculares20, rebanadas cardíacas 21 , 22, y monocapas celulares23. Consulte las referencias asociadas para diseños experimentales para recopilar datos de mapeo óptico sin procesar de estos preparativos. Siempre que los datos obtenidos se puedan convertir en una pila tiff o guardarse en un archivo . MAT, debe ser analizable usando ElectroMap. Esto incluye datos de dimensiones variables (cuadradas/rectangulares) y resoluciones (máximo probado actualmente 2048 píxeles x 2048 píxeles). 2. Instalación y puesta en marcha del software NOTA: A continuación se detallan los dos métodos para instalar y ejecutar ElectroMap, ya sea dentro de MATLAB ejecutar desde el código de origen (.m) o como un archivo ejecutable independiente (.exe para Windows). El software final y su funcionalidad son invariables entre las dos opciones de configuración (excepto algunas diferencias en la navegación de directorios). Por lo tanto, las principales consideraciones para elegir la versión para instalar son el acceso a MATLAB y las cajas de herramientas necesarias y si se desea el acceso al código fuente. Siempre que sea posible, se recomienda utilizar la versión de MATLAB para tiempos de inicio más rápidos, tiempos de procesamiento más cortos e informes de errores más sencillos. Configuración 1: Ejecución de electromapa dentro de MATLAB Instale MATLAB. ElectroMap fue diseñado en MATLAB 2017a, sin embargo, el software ha sido probado para su uso en todas las versiones posteriores de MATLAB (hasta 2018b en el momento de la escritura). Se requieren las siguientes cajas de herramientas: Procesamiento de imágenes, Procesamiento de señales, Estadísticas y aprendizaje automático y Ajuste de curva. Descargue/clone todos los archivos de la última versión de ‘código fuente’ de ElectroMap desde el repositorio GitHub (https://github.com/CXO531/ElectroMap). Descomprima el contenido descargado en la ubicación deseada. Abra MATLAB y vaya a la ubicación de la carpeta que aloja el código fuente de ElectroMap. A continuación, abra el archivo ElectroMap.m y pulse ejecutar en el editor, o bien escriba ElectroMap en la ventana de comandos y pulse RETURN. Esto iniciará la interfaz de usuario de ElectroMap, Figura 1A. Configuración 2: Archivo .exe independiente Descargue el archivo de instalación: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI. Siga las instrucciones del instalador, que descargará el tiempo de ejecución de MATLAB necesario de la web junto con el software ElectroMap. Ejecute ElectroMap.exe.NOTA: El tiempo de inicio de la versión independiente puede ser de varios minutos. 3. Carga y preprocesamiento de imágenes Pulse Seleccionar carpeta y desplácese hasta la ubicación de los archivos de datos que se van a analizar. Esto rellenará el cuadro de lista de la izquierda con todos los archivos dentro de ese directorio que son del tipo de archivo correcto (.tif o . MAT). . Los archivos MAT solo deben contener la variable de pila de imágenes.NOTA: Solo las carpetas y no los archivos individuales aparecerán a medida que navegue por el selector de directorios. Seleccione el archivo que desea cargar desde la interfaz y pulse Cargar imágenes. Una vez cargado, aparecerá el primer fotograma, y el contorno rojo indicará el umbral automático de la imagen. Si es necesario, vuelva a cargar los ROI utilizados anteriormente seleccionando Guardar/Cargar ROI. En este caso, omita el paso 3.3. De forma predeterminada, el umbral se basa en las intensidades de píxeles del primer fotograma. Si lo desea, modifique esto a un umbral basado en la amplitud del curso de tiempo de señal cambiando la opción en el menú desplegable Imagen para umbral. Tenga en cuenta que una vez seleccionado el umbral, se aplica para toda la pila de imágenes. Si lo desea, cambie la opción de umbral a manual, que activará el control deslizante para ajustar manualmente el umbral de imagen. Además, recorte imágenes (Recortar imagen) y/o dibuje una región de interés personalizada (ROI personalizado) para su análisis seleccionando las casillas de verificación adecuadas por debajo de las opciones de umbral. Tenga en cuenta que las opciones avanzadas para la selección de regiones de interés, como el número de áreas, están disponibles en Selección de ROI en el menú superior. Una vez que se haya aplicado un umbral adecuado, presione Procesar imágenes para aplicar el procesamiento. Los ajustes para el procesamiento se detallan a continuación (paso 3.4.1-3.4.5). En este punto, asegúrese de que se han introducido los ajustes correctos de la cámara. Estos son el tamaño de píxel en m (IMPORTANTE: este es el tamaño de píxel de la imagen, y no el tamaño de los píxeles que componen el chip o hardware equivalente en el dispositivo de imagen) y La velocidad de fotogramas en kHz. Para la inversión de señal, marque la casilla Invertir datos para habilitar. Si la señal fluorescente notificada es inversamente proporcional al parámetro de interés (como con los colorantes potenciométricos de uso común), la señal se puede invertir. Para el filtrado espacial, seleccione Gaussian o Average en el menú del kernel. El tamaño del área promediada espacialmente se controla mediante la entrada Tamaño adyacente al menú desplegable Kernel (es decir, 3 da como resultado un kernel de filtro de 3 píxeles x 3 píxeles). Al aplicar un filtro gaussiano, la desviación estándar también se puede establecer desde la entrada Sigma. Para la corrección de línea base, seleccione Corrección top-hat24 o polinomio (4o u 11o grado)en el menú Línea base. La corrección se puede aplicar a cada píxel individualmente (tiempo de procesamiento largo) o como un promedio de toda la imagen (más rápido pero asume alteraciones de línea base homogéneas). La corrección del sombrero superior también se puede modificar estableciendo la longitud del sombrero superior en milisegundos, adyacente al menú desplegable de selección de línea base. La longitud del núcleo Top-Hat debe ser mayor que la escala de tiempo de los potenciales de acción individuales/transitorios de calcio. Para el filtrado temporal, seleccione Filtrado de savitzky-Goaly o impulso infinito (IIR) en el menú Filtrado.NOTA: Aparte de la señal promediada de tejido que aparece en la parte inferior izquierda, el filtrado temporal se aplica a cada píxel individualmente en el momento de la cuantificación de parámetros a partir de rangos de imagen promediados del conjunto. Esto se ha implementado para reducir el tiempo de procesamiento filtrando pequeñas secciones de datos cuando sea necesario en lugar de archivos completos. Para la eliminación de fotogramas, tenga en cuenta que si se selecciona la opción Eliminar fotogramas, se pueden eliminar del conjunto de imágenes picos grandes con una amplitud mayor que la señal de interés. Esto puede ser útil en conjuntos de datos de ritmo óptico, como el ritmo optogenético, donde la despolarización se inicia mediante la activación óptica de opsins como channelrhodopsin 211,12.NOTA: Como la eliminación de fotogramas potencialmente introducirá cambios de paso no fisiológicos en las señales de imagen, el filtrado temporal puede introducir artefactos en los datos y, por lo tanto, no se recomienda aquí. Tenga en cuenta que la señal se segmentará una vez que se haya seleccionado Procesar imágenes de acuerdo con las opciones en Opciones de segmentación,sin embargo, esto se puede cambiar rápidamente sin volver a procesar todo el dataset (consulte la sección 4). 4. Segmentación de datos y promediación del conjunto NOTA: Una vez procesado el archivo, los picos en la señal promediada del tejido (traza inferior derecha, Figura 1A)habrán sido detectados y etiquetados por círculos rojos. Solo se cuentan los picos por encima de un umbral establecido (línea azul en el trazado establecido por Umbral depico). Además, los picos solo se cuentan si están suficientemente retrasados en comparación con los picos anteriores, establecidos por la entrada Distancia de pico mínimo. La señal se segmenta en función de los picos detectados. En primer lugar, la longitud del ciclo efectivo (CL) de cada pico se calcula midiendo el tiempo entre él y el siguiente pico. Si un número de picos (establecidos por la entrada Min Number of Peaks) tienen CLs similares (umbral para los cuales se establece mediante la entrada Límite mínimo), entonces se agrupan y se calcula el CL promedio para esos picos. Para una mayor segmentación de los datos, pulse Señal de segmento. Las opciones de subsegmentación son: Ninguno: todos los picos con el mismo CL agrupados; Todos: se identifican segmentos de npicos dentro de los tiempos CL constantes (npicos se establece n mediante la entrada Tamaño de segmento); Last: los picos finales n antes de identificar y agrupar un cambio CL, y no se analizan todos los demás; y Single Beat – Esto equivale a aplicar la segmentación Todo con npicos 1, por lo que no se aplica ningún promedio de agrupación o conjunto (ver 4.5). Esto se puede aplicar seleccionando el botón De un solo golpe. Aplique la segmentación personalizada de la señal acercando un momento de interés y seleccionando Segment Signal. Esto agregará una opción adicional titulada Sección ampliada al cuadro de lista de la sección, correspondiente a los puntos de tiempo seleccionados. Los resultados de la segmentación aparecerán en el cuadro de lista adyacente a la señal promediada del tejido, y mostrarán el número de sección y el CL estimado. Todas las secciones de tiempo segmentadas se indican con diferentes colores. Seleccione un segmento del cuadro de lista para resaltar esa sección en rojo. Esto también activará automáticamente los análisis de esta sección, como si se hubiera seleccionado el botón Producir mapas (ver sección 5). Los análisis de los picos agrupados se realizarán en los datos “promediados por conjunto”. Esto implica promediar los picos en un segmento juntos, siendo los tiempos de referencia los picos identificados en el paso 4.2. Actualice la ventana de tiempo a la media modificando las entradas de antes y después y presionando Señal de segmento. 5. Potencial de acción/duración transitoria de calcio y análisis de velocidad de conducción Una vez procesadas las imágenes, el botón Producir mapas se activará. Pulse Producir mapas para aplicar la duración potencial de la acción (APD), el tiempo de activación, la velocidad de conducción y el análisis SNR. De forma predeterminada, el análisis se aplicará al primer segmento de señal. Seleccione otros segmentos del cuadro de lista aplicará el análisis al segmento elegido.NOTA: Los resultados del análisis se muestran en la tabla de resultados, incluida la media, la desviación estándar, el error estándar, la varianza y el análisis del percentil 5 al 95. Sin embargo, los mapas de duración se denominan mapas de “APD”, las señales de calcio procesadas con los mismos ajustes medirán la duración transitoria del calcio. Seleccione Obtener información de píxeles para ver una visualización detallada de la señal desde cualquier píxel de la imagen y Comparar píxeles para trazar simultáneamente señales de hasta 6 ubicaciones. Utilice el panel Procesamiento de señales para ajustar la configuración del análisis de duración. Estos son: Duración – Tiempo de repolarización porcentual / decaimiento para medir desde el pico; Línea de base ‘APD’: período de tiempo de la señal que se define como línea de base de referencia para las mediciones de amplitud; y ‘APD’ Hora de inicio: hora de inicio para las mediciones de duración. Estas son las mismas opciones para decidir el tiempo de activación de los mapas isocronales (que se describen a continuación) y se denominan: Inicio ( d2F/dt2max), Upstroke (dF/dtmax), Punto medio de despolarización (tiempo de amplitud del 50%), Pico (tiempo de amplitud máxima). Estas definiciones aplicadas a los potenciales de acción del ratón y del conejillo de indias se muestran en la Figura 2A.NOTA: Al cambiar cualquiera de estas opciones, se actualizará automáticamente el mapa de duración y la tabla de resultados. También están disponibles las opciones de eliminación de escala de mapa y de valores atípicos. La velocidad de conducción también se mide automáticamente dentro de la interfaz principal del software. Esto se logra utilizando el método multi-vector de Bayly et al26 del mapa isocronal definido por la medida de activación elegida (discutido en el paso 5.4). Pulse Puntos de activación para representar una representación 3D del mapa de activación. El método de medición de velocidad de conducción multivectorsegmenta espacialmente el mapa isocronal en regiones de n x n píxeles. Establezca el valor de n utilizando la entrada Tamaño de ventana local y establezca el intervalo de tiempos de activación para aplicar el análisis mediante las entradas Tiempos de activación de ajuste.NOTA: Para cada región local, se ajusta una superficie polinómica, f, que mejor describe la relación entre el tiempo de activación y la posición espacial, (x,y). El vector de degradado, CVlocal, de esta superficie se calcula como:①donde denota el operador diferencial espacial cartesiano bidimensional26. Para cada píxel del mapa isocronal, se calcula un vector local que representa la velocidad y la dirección de conducción. Seleccione Mapa isocronal con vectores en el menú desplegable de visualización para ver este análisis. El SNR se calcula como la relación de la amplitud máxima en comparación con la desviación estándar de la señal en la línea de base. Este análisis se realiza para contabilizar todos los pasos de procesamiento. Pulse cálculo SNR en el menú superior para editar los ajustes del período de la señal definida como línea base. 6. Módulo de análisis de conducción Presione Conducción para acceder a un análisis más detallado de la velocidad de conducción. Esto abre un módulo separado donde la conducción se puede cuantificar utilizando el método multivector Bayly como en la interfaz principal, métodos vectoriales únicos y como una curva de activación. Pulse Vector único para analizar la conducción utilizando el método de vector único, donde el CV se calcula a partir del retardo en el tiempo de activación entre dos puntos. Esto se puede hacer usando métodos Automático o Manual, seleccionable debajo del botón Vector único. Para el método automático de vector único, seleccione una distancia y un punto de inicio desde el que medir la conducción. A continuación, el software realizará un barrido de 360 grados desde el punto seleccionado, midiendo el retardo de tiempo y calculando la velocidad de conducción asociada a lo largo de todas las direcciones en incrementos de 1 grado. Los resultados de este análisis se muestran en el gráfico adyacente al mapa, y la dirección de la conducción más lenta se muestra en rojo. Para el método vectorial único manual, elija un punto inicial y final del mapa isocronal para calcular la velocidad de conducción. Para seleccionar un nuevo punto de inicio, pulse Borrar punto de inicio. Presione Vector local para aplicar el método multivector, con los ajustes que coinciden con los de la interfaz principal. Dentro del módulo de conducción, se puede visualizar la distribución de las velocidades de conducción, así como la distribución angular de vectores calculados y la dependencia angular de la velocidad de conducción. Presione la curva de activación para trazar el porcentaje de tejido activado en función del tiempo. El tiempo hasta el 100% de activación se muestra automáticamente, mientras que también se pueden seleccionar los valores personalizados para los porcentajes de activación mínimos (azul) y máximos (rojos) entre los que se puede medir. 7. Análisis y módulos adicionales Aparte de los análisis de duración y velocidad de conducción realizados automáticamente, se pueden cuantificar varios otros parámetros mediante ElectroMap. Estos análisis se pueden seleccionar en el menú desplegable situado encima del mapa de visualización. Seleccione una de estas opciones para realizar el análisis, y los resultados aparecerán en la 4a fila de la tabla de resultados: 1) Intervalo diastólico – Tiempo de repolarización del 90% al tiempo de activación del siguiente potencial de acción; 2) Frecuencia dominante – El espectro de frecuencia de cada píxel se calcula utilizando la transformación rápida de Fourier, y la frecuencia con más potencia se define como la frecuencia dominante. Los ajustes avanzados de rango y ventana para el análisis de frecuencia dominante están disponibles seleccionando Asignaciónde frecuencia; 3) Tiempo hasta el pico – El tiempo de aumento entre dos porcentajes seleccionados por el usuario (por defecto 10 a 90%) fase de despolarización del potencial de acción o la liberación de calcio. Los valores de porcentaje se pueden cambiar seleccionando Configuración de TTP; y 4) Constante de relajación ()– La constante de relajación se calcula ajustando una decadencia monoexponencial de la forma de la forma:②donde el nivel de fluorescencia en el tiempo t depende del pico de fluorescencia, F0, y la decadencia posterior (C es una constante)27. El valor entre el que se ajustará la ecuación 2 se pueden seleccionar dentro de las interfaces de usuario principales de ElectroMap, así como una bondad de criterios de exclusión de ajuste basados en el valor r 2. Pulse Análisis de archivo único para abrir un módulo dedicado para la duración de alto rendimiento y el análisis de conducción de cada segmento identificado en un archivo. El análisis se puede realizar en toda la imagen (duración, conducción y tiempo de activación) o en regiones o puntos de interés seleccionados (solo duración actual). Los resultados se generan en un archivo .csv.NOTA: Para los valores APD de toda la imagen, la primera columna del archivo .csv es la media, mientras que la segunda columna es la desviación estándar. Presione Alternans para iniciar un módulo independiente para el análisis dedicado y el mapeo de la variabilidad beat-to-beat. 201913 para obtener más información sobre las opciones de procesamiento y análisis de alternancias. Específicamente, este módulo está diseñado para identificar dos oscilaciones de período, conocidas como alternancias. Los alternancias de duración y amplitud se calculan y se generan.NOTA: Los alternadores de duración se miden comparando la medición de duración de un pico al siguiente; es decir, si el pico uno y dos y APD1 y APD2 respectivamente, entonces la alternancia de duración (APD) se calcula como③La medición de la duración se realiza utilizando los ajustes de la interfaz principal. Mientras tanto, los alternadores de amplitud se pueden cuantificar y mapear a través de preparaciones multicelulares como un cambio absoluto (definido como un porcentaje en el que el 0% es la misma amplitud entre un latido y el siguiente). Además, los efectos de fenómenos como la carga de calcio pueden investigarse más a fondo midiendo y comparando alternadores de carga y liberación, como se ha informado anteriormente28. Si L se define como la amplitud máxima de los latidos grandes (es decir, donde la amplitud esmayor que el latido anterior), S la amplitud de los latidos pequeños, yD la carga diastólica de los latidos pequeños, la liberación alterna ( ) se definen como:(4)Por el contrario, losalternadores de carga ( ) se definen como:(5)Las mediciones de Alternans se pueden hacer a través de todo el tejido, y los resultados del análisis se muestran en la parte inferior derecha del módulo. Cuando se utiliza por primera vez el módulo, el análisis se realiza en todo el archivo experimental, y los resultados mostrados son una diferencia de ritmo promedio en todo el archivo. Sin embargo, el análisis se puede restringir a tiempos específicos en el archivo anulando la selección de Mantener zoom, ampliando un período de tiempo específico y seleccionando Analizar sección ampliada. Esto actualizará el panel de resultados para mostrar el análisis del período de tiempo seleccionado. Seleccione play para mostrar un vídeo de ritmo a ritmo del análisis de alternans. Además, seleccione Crear mapa medio para exportar un mapa del comportamiento de alternancias promediado desde los puntos de tiempo de selección, que se establecen en el menú emergente al utilizar esta función. Presione Mapa de fase para iniciar el módulo de asignación de fase. Se realiza una transformación Hilbert para calcular la fase instantánea (entre – – y + ) de las señales en cada punto de tiempo. Presione el control deslizante play o drag para visualizar el comportamiento de fase a lo largo del tiempo y haga clic en un píxel para representar un diagrama de fases. 8. Exportación de datos Los datos se exportan desde ElectroMap en una variedad de formas. Pulse Exportar valores para guardar los valores del mapa que se muestra actualmente en la interfaz utilizada principal. Los valores medidos se pueden guardar como un mapa (conservando ubicaciones de píxeles) o condensarse en una sola lista, y se pueden guardar como .csv, .txt o . Archivos MAT. Pulse Exportar mapa para abrir una ventana emergente que contenga el mapa que se muestra actualmente, que luego se puede guardar en una variedad de formatos de imagen. Las opciones de visualización del mapa se controlan seleccionando Configuración del mapa, pero también se pueden editar una vez que se ha seleccionado Exportar mapa. Por ejemplo, se puede agregar una barra de colores seleccionando este icono en el menú superior, y la escala se puede establecer seleccionando Edición > Mapa decolores . Pulse Vídeo de activación para representar una animación de la secuencia de activación, que se puede guardar como un archivo .gif animado. Pulse Segmento de vídeo para guardar un archivo de vídeo .avi del parámetro que se muestra actualmente de cada segmento identificado.