شبه كمية المخدرات تقارب استجابة الهدف الاستقرار (DARTS) دراسة التفاعل راباميسين / mTOR
Summary
في هذه الدراسة، عززنا قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. ويمكن رسم التفاعلات في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية.
Abstract
استقرار الهدف المستجيب للأدوية (DARTS) هو طريقة قوية للكشف عن أهداف بروتين جزيء صغير جديدة. ويمكن استخدامه للتحقق من التفاعلات الصغيرة المعروفة بين الجزيئات والبروتين والعثور على أهداف البروتين المحتملة للمنتجات الطبيعية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، DARTS يستخدم الأصلي، غير المعدلة، جزيئات صغيرة وبسيطة وسهلة التشغيل. في هذه الدراسة، قمنا بزيادة تعزيز قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. يمكن رسم تفاعلات البروتين ligand في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية لوضع بروتوكولنا. من منحنى بروتيوليتيك رأينا أن البروتيوليز من mTOR من قبل بروناز كان يمنعها وجود رابامايسين. منحنى الاعتماد على الجرعة سمح لنا لتقدير التقارب ملزمة من رابامايسين وmTOR. ومن المرجح أن تكون هذه الطريقة طريقة قوية وبسيطة لتحديد البروتينات المستهدفة الجديدة بدقة ولتحسين المشاركة المستهدفة في مجال المخدرات.
Introduction
تحديد البروتينات المستهدفة جزيء صغير ضروري لفهم الميكانيكية وتطويرالأدوية العلاجية المحتملة 1،2،3. الكروماتوغرافيا التقارب، كطريقة كلاسيكية لتحديد البروتينات المستهدفة من الجزيئات الصغيرة، وقد أسفرت عن نتائج جيدة4،5. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها قيود، في أن التعديل الكيميائي للجزيئات الصغيرة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض أو تغيير خصوصية ملزمة أو تقارب. وللتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا ً وضع وتطبيق عدة استراتيجيات جديدة لتحديد أهداف الجزيئات الصغيرة دون تعديل كيميائي للجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه الطرق المباشرة لتحديد الهدف من الجزيئات الصغيرة خالية من الملصقات استقرار الهدف استجابة المخدرات (DARTS)6، واستقرار البروتينات من معدلات الأكسدة (SPROX)7، فحص التحول الحراري الخلوي (CETSA)8 ،9، والحرارية البروتيوم التنميط (TPP)10. هذه الأساليب هي مفيدة للغاية لأنها تستخدم جزيئات طبيعية صغيرة غير معدلة وتعتمد فقط على التفاعلات ملزمة مباشرة للعثور على البروتينات المستهدفة11.
من بين هذه الأساليب الجديدة، DARTS هو منهجية بسيطة نسبيا التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل معظم مختبرات12،13. يعتمد السهام على مفهوم أن البروتينات المرتبطة بالرباط تظهر قابلية معدلة للتحلل الأنزيمي بالنسبة للبروتينات غير المنضمة. ويمكن الكشف عن البروتين المستهدف الجديد عن طريق فحص النطاق المعدل في جل SDS-PAGE من خلال قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS). تم تنفيذ هذا النهج بنجاح لتحديد الأهداف غير المعروفة سابقا من المنتجات الطبيعية والأدوية14،15،16،17،18، 19.كما أنها قوية كوسيلة لفحص أو التحقق من صحة ربط المركبات لبروتين معين20،21. في هذه الدراسة، نقدم تحسينا للتجربة من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين مع الجزيئات الصغيرة وتحديد الروابط ملزمة البروتين-ligand. نحن نستخدم mTOR- rapamycin التفاعل كمثال لإثبات نهجنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
DARTS يسمح لتحديد أهداف جزيء صغير عن طريق استغلال تأثير وقائي من البروتين ملزمة ضد التدهور. DARTS لا يتطلب أي تعديل كيميائي أو تجميد جزيء صغير26. وهذا يسمح للجزيئات الصغيرة لاستخدامها لتحديد أهدافالبروتين ملزمة مباشرة. معايير التقييم القياسية لطريقة السهام الكلاسيكية تشمل تلطيخ ه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المنح البحثية NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ومنحة بحثية من قبل إدارة الوتّز W81XWH-16-1-0482.
Materials
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
- O’Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
- McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
- Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
- Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
- Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
- Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
- Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
- Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
- Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
- Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
- Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
- Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
- Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
- Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
- Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
- Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
- Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
- Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
- Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).
