Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus
Summary
Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 ‘-região não traduzida (UTR) e 3 ‘-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.
Abstract
Cada mRNA do poxvirus transcrito após a replicação viral do ADN tem um 5 ‘-Poly (A) evolutivamente conservado, não-modelado do 5 ‘-UTR. Para dissecar o papel de 5 ‘-Poly (A) líder na tradução de mRNA durante a infecção do poxvirus nós desenvolvemos in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Este ensaio do repórter compreende de quatro etapas do núcleo: (1) PCR para amplificar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA usando T7 RNA polimerase; (3) transfecção para introduzir in vitro o mRNA transcrito nas pilhas; (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução. O ensaio do repórter do luciferase RNA-baseado descrito aqui contorna edições da replicação do plasmídeo em pilhas poxvirus-contaminadas e na transcrição enigmático do plasmídeo. Este protocolo pode ser usado para determinar o Regulamento da tradução por cis-elementos em um mRNA que inclui 5 ‘-UTR e 3 ‘-UTR nos sistemas diferentes das pilhas poxvirus-contaminadas. Além disso, diferentes modos de iniciação de tradução, como o tampão-dependente, Cap-Independent, re-iniciação, e iniciação interna podem ser investigados usando este método.
Introduction
De acordo com o dogma central, a informação genética flui do DNA para o RNA e, finalmente, para a proteína1,2. Este fluxo de informação genética é altamente regulamentado em vários níveis,incluindo a tradução mRNA3,4. O desenvolvimento de ensaios de repórter para medir a regulação da expressão gênica facilitará a compreensão dos mecanismos regulatórios envolvidos nesse processo. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a tradução do mRNA usando um in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase em pilhas poxvirus-infected.
Os poxvirus compreendem muitos micróbios patogénicos humanos e animais altamente perigosos5. Como todos os outros vírus, os poxvirus dependem exclusivamente de máquinas de células hospedeiras para síntese protéica6,7,8. Para sintetizar de forma eficiente as proteínas virais, os vírus evoluíram com muitas estratégias para a seqüestro da maquinaria translacional celular para redirecioná-la para a tradução de mRNAs virais7,8. Um mecanismo comumente empregado por vírus é o uso de elementos de ação cisem suas transcrições. Exemplos notáveis incluem o local de entrada Ribossome interna (ires) e o potenciador de tradução independente de Cap (CITE)9,10,11. Esses cis-elementos tornam as transcrições virais uma vantagem translacional atraindo máquinas translacionais através de diversos mecanismos12,13,14. Mais de 100 mRNAs de Poxvirus têm um elemento cis-acting evolutivamente conservado na região 5 ‘-Untranslated (5 ‘-UTR): um 5 ‘-Poly (a) líder no muito 5 ‘ extremidades destes mRNAs15,16. Os comprimentos destes 5 ‘-Poly (a) os líderes são heterogêneos e são gerados pelo derrapagem da polimerase poxvirus-codificada do RNA durante a transcrição17,18. Nós, e outro, descobrimos recentemente que o 5 ‘-Poly (a) o líder confere uma vantagem da tradução a um mRNA nas pilhas contaminadas com o vírus de vaccinia (vacv), o membro prototípicas de Poxvirus19,20.
O ensaio de repórter de luciferase baseado em RNA transcrito in vitro foi inicialmente desenvolvido para compreender o papel do líder 5 ‘-Poly (a) na tradução de mRNA durante a infecção pelo poxvirus19,20. Embora os ensaios do repórter do luciferase DNA-baseado do plasmídeo sejam amplamente utilizados, há diversos inconvenientes que complicarão a interpretação do resultado em pilhas poxvirus-contaminadas. Em primeiro lugar, os plasmís são capazes de replicar em células infectadas VACV22. Em segundo lugar, a transcrição críptica geralmente ocorre a partir do plasmídeo DNA18,23,24. Em terceiro lugar, a transcrição impulsionada pelo promotor VACV gera poli (A)-líder de comprimentos heterogêneos, consequentemente, dificultando o controle do comprimento do líder Poly (A) em alguns experimentos18. Um ensaio in vitro transcrito do repórter da luciferase baseado em RNA contorna estas edições e a interpretação dos dados é direta.
Há quatro etapas chaves neste método: (1) reacção em cadeia do polymerase (PCR) para gerar o molde do ADN para a transcrição in vitro; (2) transcrição in vitro para gerar mRNA; (3) transfection para entregar o mRNA nas pilhas; e (4) detecção da atividade da luciferase como indicador de tradução (Figura 1). O amplicon resultante do PCR contem os seguintes elementos no sentido 5 ‘ a 3 ‘: T7-promotor, líder poli (A) ou 5 ‘-seqüência desejada de UTR, frame de leitura aberto do luciferase do Firefly (ORF) seguido por uma cauda poli (A). O amplicon do PCR é usado como o molde para sintetizar mRNA pela transcrição in vitro usando o polymerase de T7. Durante a transcrição in vitro, o tampão de m7G ou o outro Analog do tampão são incorporados no mRNA recentemente sintetizado. As transcrições tampadas são transfected em células não infectadas ou VACV-infectadas. O lisado da pilha é coletado no tempo desejado após o transfection para medir atividades do luciferase que indicam a produção da proteína do mRNA transfected. Este ensaio do repórter pode ser usado para estudar a regulação da tradução pelo cis-elemento atual em 5 ‘-UTR, em 3 ‘-UTR ou em outras regiões de um mRNA. Além disso, o ensaio in vitro transcrito RNA-baseado pode ser usado para estudar os mecanismos diferentes da iniciação da tradução que incluem a iniciação tampão-dependente, a iniciação tampão-independente, a reiniciação e a iniciação interna como IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todas as etapas do quatro-núcleo são críticas ao sucesso do in vitro transcrito RNA-baseou o ensaio do repórter do luciferase. Uma atenção especial deve ser dada ao projeto da primeira demão, especial para a seqüência do promotor T7. T7 RNA polymerase começa a transcrição do sublinhado primeiro G (ggg-5 ‘-UTR-Aug-) em T7 promotor adicionado antes da seqüência de 5 ‘-UTR. Embora o local do começo da transcrição (TSS) Comece do primeiro G no 5 ‘ extremidade, diminuindo o número de G ‘ s menos de tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto foi financiado pelos institutos nacionais de saúde (AI128406 www.nih.gov) para ZY e em parte pelo centro de pesquisa de câncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu), na forma de estudante de pós-graduação Summer stipend para PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
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