Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo
Summary
Vi presenterer en tilnærming for å rense ribosom-bundet mRNA fra vaskulær endothelial celler (ECs) direkte i mus hjernen, lunge og hjerte vev via EC-spesifikk genetisk kode av forbedret grønt fluorescens protein (EGFP) i ribosomer i kombinasjon med RNA rensing .
Abstract
Mange studier har vært begrenset til å bruke in vitro cellulære analyser og hele vev eller isolere bestemte celletyper fra dyr for in vitro analyse av transcriptome og genuttrykk ved qPCR og RNA sekvensering. Omfattende transcriptome og genuttrykk analyse av bestemte celletyper i komplekse vev og organer vil være avgjørende for å forstå cellulære og molekylære mekanismer som gener er regulert og deres tilknytning til vev homeostase og organ Funksjoner. I denne artikkelen viser vi metodikken for isolering av ribosom RNA direkte in vivo i vaskulær endothelia av animalsk lunger som et eksempel. De spesifikke materialene og prosedyrene for vevs behandling og RNA-rensing vil bli beskrevet, inkludert vurderingen av RNA-kvalitet og-utbytte i tillegg til sanntids qPCR for arteriogenic genanalyser. Denne tilnærmingen, kjent som å oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) teknikk, kan benyttes for karakterisering av genuttrykk og transcriptome analyse av enkelte celletyper direkte i vivo i en bestemt type i komplekse vev.
Introduction
I komplekse vev som pattedyr hjernen, hjerte og lunge, de høye nivåene av cellulære heterogenitet komplisere analyse av genuttrykk data avledet fra hele vevsprøver. For å observere gen uttrykks profiler i en bestemt celle type in vivo, har en ny metodikk blitt utviklet nylig, noe som gjør at avhør av hele oversatte mRNA komplement av genetisk definert celle type. Denne metodikken er kjent som oversette ribosom affinitet rensing (Trap) teknikk1,2. Det er et nyttig redskap for å studere endothelial cellebiologi og angiogenese kombinert med genetisk manipulering av andre angiogenese gener hos dyr.
Vi har vist at angiogenic PKD-1 signalering og transkripsjon av angiogenic Gene CD36 er avgjørende for endothelial celle (EC) differensiering og funksjonell angiogenese3,4,5,6. For å bestemme molekylære mekanismer for angiogenic og metabolske signalering i gen transkripsjon og EC transdifferentiation, har vi skapt genetisk konstruert TRAP mus med spesielt slettet angiogenic gener på grunnlag av TRAP teknikk1 , 2. videre, i våre Trap dyr, ikke bare har de PKD-1 eller cd36 gen mangel i vaskulær endothelia eller global sletting av cd36 Gene, men en forbedret grønn fluorescens protein (EGFP) er også genetisk tagget på EC ‘ s oversette ribosomer. TRAP tillater affinitet rensing av ribosom-bundet mRNA direkte fra vaskulær endothelia av målrettede vev, slik at analyse av genuttrykk og identifisering av nye transcriptomes som er forbundet med EC differensiering og angiogenese direkte under in vivo-forhold. Vi har med hell isolert ribosom-bundet RNA fra endothelia i disse genetisk konstruerte dyrene. Den renset RNA kan brukes for ytterligere karakterisering av angiogenic eller arteriogenic gener i regulering av EC differensiering og funksjoner. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning for å implementere TRAP-tilnærmingen for isolering av mRNA i ECs direkte in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese er en kompleks flertrinnsprosess, der EC-spesifikke angiogenic genet transkripsjon og uttrykk spiller en viktig rolle i EC differensiering og angiogenic omprogrammering3,4. For å overkomme barrierene fra det cellulære mangfoldet og arkitektoniske kompleksiteten for bedre å forstå funksjonen til pattedyr vaskulære system på et molekylnivå i Vivo, har vi opprettet EC-spesifikke FELLE mus, ledsaget av EC-spesifikke cd36 , EC-spesifikk <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. ren arbeid er støttet av American Heart Association (13SDG14800019; BR), Ann ‘ s Hope Foundation (FP00011709; BR), American Cancer Society (86-004-26, den MCW Cancer Center til BR), og National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan palmer er støttet av 2018 MCW CTSI 500 Stars internship program; P. Moran er støttet av en institusjonell Research Training Grant fra NHLBI (5T35 HL072483-34).
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
