Summary

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Published: May 25, 2019
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Summary

Nous présentons une approche pour purifier l’ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l’intermédiaire de l’étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d’ARN .

Abstract

De nombreuses études ont été limitées à l’utilisation d’essais cellulaires in vitro et de tissus entiers ou l’isolating de types cellulaires spécifiques d’animaux pour l’analyse in vitro du transcriptome et l’expression des gènes par qPCR et le séquençage de l’ARN. L’analyse complète de transcriptome et d’expression génique de types cellulaires spécifiques dans des tissus et organes complexes sera essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les gènes sont réglementés et leur association avec l’homéostasie tissulaire et l’organe Fonctions. Dans cet article, nous démontrons la méthodologie pour l’isolement de l’ARN ribosome-lié directement in vivo dans l’endothélia vasculaire des poumons animaux comme exemple. Les matériaux et procédures spécifiques pour le traitement des tissus et la purification de l’ARN seront décrits, y compris l’évaluation de la qualité et du rendement de l’ARN ainsi que qPCR en temps réel pour les essais de gènes artériogènes. Cette approche, connue sous le nom de technique de purification d’affinité de ribosome de traduction (TRAP), peut être employée pour la caractérisation de l’expression de gène et de l’analyse de transcriptome de certains types de cellules directement in vivo dans n’importe quel type spécifique dans les tissus complexes.

Introduction

Dans les tissus complexes tels que le cerveau, le cœur et le poumon des mammifères, les niveaux élevés d’hétérogénéité cellulaire compliquent l’analyse des données d’expression génique dérivées d’échantillons de tissus entiers. Pour observer les profils d’expression génique dans un type de cellule particulier in vivo, une nouvelle méthodologie a été développée récemment, qui permet l’interrogation de l’ensemble de l’ARNm traduit de tout type de cellule génétiquement défini. Cette méthodologie est connue sous le nom de traduction ribosome affinity purification (TRAP) technique1,2. C’est un outil utile pour étudier la biologie cellulaire endothéliale et l’angiogenèse lorsqu’il est combiné avec la manipulation génétique d’autres gènes associés à l’angiogenèse chez les animaux.

Nous avons montré que la signalisation angiogénique PKD-1 et la transcription du gène angiogénique CD36 sont critiques pour la différenciation des cellules endothéliales (EC) et l’angiogenèse fonctionnelle3,4,5,6. Pour déterminer les mécanismes moléculaires de la signalisation angiogénique et métabolique dans la transcription génique et la transdifférenciation EC, nous avons créé des souris TRAP génétiquement modifiées avec des gènes angiogéniques spécifiquement supprimés sur la base de la technique TRAP1 , 2. En outre, chez nos animaux TRAP, non seulement ils ont une déficience génétique pkd-1 ou cd36 dans l’endothélia vasculaire ou la suppression globale du gène cd36, mais une protéine de fluorescence verte améliorée (EGFP) est également génétiquement étiquetée sur EC traduise des ribosomes. TRAP permet la purification d’affinité de l’ARNm lié au ribosome directement à partir de l’endothelia vasculaire des tissus ciblés, permettant l’analyse de l’expression génique et l’identification de nouveaux transcriptomes qui sont associés à la différenciation des CE et angiogenèse directement dans des conditions in vivo. Nous avons réussi à isoler l’ARN lié au ribosome de l’endothélie chez ces animaux génétiquement modifiés. L’ARN purifié peut être utilisé pour la caractérisation des gènes angiogéniques ou artériogéniques dans la régulation de la différenciation et des fonctions eC. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour mettre en œuvre l’approche TRAP pour l’isolement de l’ARNm dans les EC directement in vivo.

Protocol

Pour les expériences animales, toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Medical College of Wisconsin. 1. Préparer des réactifs Préparer un tampon de lyse à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cycloheximide, inhibiteurs de la protéase, et inhibiteurs recombinants RNase aux concentrations telles que décrites ci-dessous. Aj…

Representative Results

Nos études précédentes4,7 suggèrent que CD36 peut fonctionner comme un commutateur pour la différenciation artériolaire et l’artérielisation capillaire par l’intermédiaire de la voie de signalisation De LPA/PKD-1. Pour étudier si l’axe de signalisation LPA/PKD-1-CD36 est essentiel pour l’artériogenèse in vivo, nous avons établi les nouvelles lignes TRAP qui non seulement ont une carence mondiale en cd36 ou endothélial-spécifique-cd36- ou pkd-1-défi…

Discussion

L’angiogenèse est un processus complexe en plusieurs étapes, dans lequel la transcription et l’expression de gènes angiogéniques spécifiques aux CE jouent un rôle essentiel dans la différenciation et la reprogrammation angiogénique3,4. Pour surmonter les barrières de la diversité cellulaire et de la complexité architecturale pour mieux comprendre la fonction du système vasculaire des mammifères au niveau moléculaire in vivo, nous avons créé des so…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travail du Dr Ren est soutenu par l’American Heart Association (13SDG14800019; BR), la Fondation Ann’s Hope (FP00011709; BR), l’American Cancer Society (86-004-26; MCW Cancer Center to BR), et le National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer est soutenu par le programme de stages MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran bénéficie d’une subvention de formation en recherche institutionnelle de NHLBI (5T35 HL072483-34).

Materials

2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips Agilent G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Cell scrapers Sarstedt 83.1832
Homogenizers Fisher Scientific K8855100020
Magnet (Dynamag-2) Invitrogen 123-21D Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2
Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotometer Thermo Scientific  ND-2000C
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5430R with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes
RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes Applied Biosystems  AM12450
Rnase-free 50-mL conical tubes Applied Biosystems  AM12501
RNase-free 1000-μl filter tips Rainin RT-1000F
RNase-free 200-μl filter tips Rainin  RT-200F
RNase-free 20-μl filter tips Rainin  RT-20F
Rotor for homogenizers Yamato  LT-400D
Tube rotator, Labquake brand Thermo Fisher 13-687-12Q

References

  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
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Cite This Article
Moran, P., Guo, Y., Yuan, R., Barnekow, N., Palmer, J., Beck, A., Ren, B. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (147), e59624, doi:10.3791/59624 (2019).

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