Summary

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Published: June 19, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Abstract

In dit artikel presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor het behoud van neutrofiele-Lineage cellen in Fresh BM voor hele BM CyTOF analyse. We gebruikten een myeloïde-bevooroordeelde 39-antilichaam CyTOF panel om de hematopoietische systeem te evalueren met een focus op de neutrofiele-Lineage cellen met behulp van dit protocol. De CyTOF resultaat werd geanalyseerd met een open-resource dimensionale reductie algoritme, viSNE, en de gegevens werd gepresenteerd aan de uitkomst van dit protocol aan te tonen. We hebben ontdekt nieuwe neutrofiele-Lineage Cell populaties op basis van dit protocol. Dit Protocol van verse hele BM voorbereiding kan worden gebruikt voor 1), CyTOF analyse om niet-geïdentificeerde cel populaties te ontdekken van hele BM, 2), het onderzoeken van hele BM gebreken voor patiënten met bloedziekten zoals leukemie, 3), assisteren optimalisering van fluorescentie-activated flow Cytometry protocollen die gebruik maken van verse hele BM.

Introduction

In de afgelopen decennia, Cytometry methoden zijn een krachtig instrument om het hematopoietische systeem te onderzoeken in de BM. Deze methodes omvatten fluorescentie-geactiveerde Stroom Cytometry en de nieuwe methode van CyTOF gebruikend zware metaal-geëtiketteerde antilichamen. Ze hebben geleid tot ontdekkingen van vele soorten cellen in een heterogene biologisch specimen door identificatie van hun unieke oppervlakte marker expressieprofielen. Verhoogde spectrum overlappingen die geassocieerd zijn met meer kanalen leidt tot hogere gegevens onnauwkeurigheid in fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen. Daarom worden ongewenste cellen routinematig verwijderd om de cel populaties van belang te verrijken voor fluorescentie-activated flow Cytometry analyse. Bijvoorbeeld, Ly6G (of GR-1) en CD11b worden beschouwd als volwassen myeloïde Cell markers en Ly6G+ (of GR-1+) en CD11b+ cellen worden routinematig verwijderd uit BM monsters met behulp van magnetische verrijking kits voorafgaand aan flow Cytometry analyse van hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) of door het combineren van deze markers in een dump cocktail kanaal1,2,3. Een ander voorbeeld is dat neutrofielen routinematig uit menselijk bloed specimen worden verwijderd om perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor immunologische studies te verrijken. Hele beenmerg geïsoleerd van de muis of de mens, echter, is zelden onderzocht intact voor Cytometry analyse.

Onlangs is CyTOF een revolutionair hulpmiddel geworden om het hematopoietische systeem4,5,6te onderzoeken. Met CyTOF, worden de fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vervangen door zwaar element reporter-geëtiketteerde antilichamen. Deze methode maakt het mogelijk voor de meting van meer dan 40 markers gelijktijdig zonder de zorg van het spectrum overlap. Het heeft de analyse van intact biologisch specimen zonder pre-uitputtings stappen of een stortplaats kanaal toegelaten. Daarom kunnen we het hematopoietische systeem uitvoerig bekijken met een hoge-inhoud dimensionaliteit van conventionele 2-D flow Cytometry percelen. Cel populaties weggelaten in het verleden tijdens uitputting of gating proces kan nu worden gebracht in het licht met de High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF4,5. We hebben een antilichamen paneel ontworpen dat gelijktijdig 39 parameters in het hematopoietische systeem meet met een focus op de myeloïde linage7. Vergeleken met de conventionele flow Cytometry gegevens, de interpretatie en visualisatie van de ongekende single-cell High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF is een uitdaging. Computationele wetenschappers hebben ontwikkeld dimensionaliteit reductie technieken voor de visualisatie van High-dimensionale datasets. In dit artikel, gebruikten we het algoritme, viSNE, die t-Distributed stochastische buurman inbedding (t-GND) techniek gebruikt om de CyTOF gegevens te analyseren en om de High-dimensionale resultaat presenteren op een 2-dimensionale kaart, terwijl het behoud van de High-dimensionale structuur van de gegevens8,9,10. Op de tSNE plot worden soortgelijke cellen gegroepeerd in subsets en de kleur wordt gebruikt om de functie van de cellen te markeren. Bijvoorbeeld, op Figuur 1 worden de myeloïde cellen verdeeld in meerdere cel subsets gebaseerd op de gelijkenissen van hun expressie patronen van 33 oppervlakte markers vloeide voort uit CyTOF (Figuur 1)4. Hier hebben we onderzocht muis beenmerg met onze eerder gemelde 39-marker CyTOF panel door viSNE Analysis7. viSNE analyse van onze CyTOF gegevens bleek een niet-geïdentificeerde cel populatie die zowel HSPC (CD117+) en neutrofiele (Ly6G+) kenmerken (Figuur 2)7toonde.

Samenvattend, presenteren wij een protocol om vers geheel beenmerg voor CyTOF analyse te verwerken. In dit artikel, gebruikten we muis beenmerg als een voorbeeld, terwijl dit protocol kan ook worden gebruikt voor het verwerken van menselijk beenmerg monsters. De details die specifiek zijn voor het menselijk beenmerg monsters zijn ook vermeld in het protocol als goed. Het voordeel van dit protocol is dat het Details zoals incubatietijd en temperatuur bevat die werden geoptimaliseerd om neutrofiele-Lineage cellen in het gehele beenmerg te bewaren om onderzoek op het intacte gehele beenmerg toe te laten. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen.

Protocol

Alle experimenten volgden goedgekeurde richtlijnen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie de dierlijke zorg en het gebruiks Comité, en de goedkeuring voor het gebruik van knaagdieren werden verkregen van het Instituut van La Jolla voor allergie en immunologie volgens criteria die in de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de nationale gezondheidsinstituten. 1. het beenmerg van de oogstmuis (BM) Koop C57BL/6J muizen van een commerciële leve…

Representative Results

Figuur 1 wordt gepresenteerd als een voorbeeld resultaat van CyTOF experimenten. Op deze tSNE plot de cellen over meerdere muis weefsels werden geclusterd in deelverzamelingen op basis van de gelijkenis van hun oppervlakte marker expressieprofielen gemeten door een 33-parameter CyTOF paneel. Cellen met meer vergelijkbare eigenschappen werden automatisch gegroepeerd, zoals de neutrofielen, macrofagen, of de DCs gebaseerd op de expressie van de 33 markers op elke cel. <p class="jove_conten…

Discussion

In de afgelopen decennia, fluorescentie-based flow Cytometry werd gebruikt als de belangrijkste methode om cellulaire lineages en heterogeniteit1,2,3studie. Hoewel flow Cytometry heeft multi-dimensionale gegevens, deze methode is beperkt door keuzes van parameters en spectrale overlap. Om de zwakheid van Stroom Cytometry te overwinnen namen wij voordeel van CyTOF, die zware metaal isotopen in plaats van fluorophores gebruikt om …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag de LJI flow Cytometry core bedanken voor hulp bij de massa Cytometry procedure. Dit werk werd gesteund door NIH verleent R01HL134236, P01HL136275, en R01CA202987 (allen aan C. C. H) en ADA7-12-MN-31 (04) (aan C.C.H. en Y. P. Z).

Materials

CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y Fluidigm Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb Fluidigm Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified Biolegend Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified Biolegend Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er Fluidigm Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified Biolegend Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd Fluidigm Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd Fluidigm Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er Fluidigm Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified Biolegend Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified Biolegend Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified Biolegend Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified Biolegend Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified Biolegend Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd Fluidigm Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd Fluidigm Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready ThermoFisher Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified Biolegend Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified Biolegend Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb Fluidigm Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb Fluidigm Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm Fluidigm Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified abcam Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho Fluidigm Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified BD Biosciences Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd Fluidigm (Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready Biolegend Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer CANDOR Bioscience Cat# 130050
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich Cat# A4503
Cisplatin-194Pt Fluidigm Cat# 201194
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer ThermoFisher Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum Omega Scientific Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution GE Lifesciences Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir Fluidigm Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits Fluidigm http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich Cat# 158127
Sodium azide Sigma-Aldrich Cat# S2002
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# X100
Trypsin EDTA 1X Corning Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J The Jackson Laboratory Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer Finck et al., 2013 https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank Cytobank https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0 Chen et al., 2016 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE van der Maaten and Hinton, 2008 https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

References

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Zhu, Y. P., Padgett, L., Dinh, H. Q., Marcovecchio, P., Wu, R., Hinz, D., Kim, C., Hedrick, C. C. Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells. J. Vis. Exp. (148), e59617, doi:10.3791/59617 (2019).

View Video