Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.
In dit artikel presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor het behoud van neutrofiele-Lineage cellen in Fresh BM voor hele BM CyTOF analyse. We gebruikten een myeloïde-bevooroordeelde 39-antilichaam CyTOF panel om de hematopoietische systeem te evalueren met een focus op de neutrofiele-Lineage cellen met behulp van dit protocol. De CyTOF resultaat werd geanalyseerd met een open-resource dimensionale reductie algoritme, viSNE, en de gegevens werd gepresenteerd aan de uitkomst van dit protocol aan te tonen. We hebben ontdekt nieuwe neutrofiele-Lineage Cell populaties op basis van dit protocol. Dit Protocol van verse hele BM voorbereiding kan worden gebruikt voor 1), CyTOF analyse om niet-geïdentificeerde cel populaties te ontdekken van hele BM, 2), het onderzoeken van hele BM gebreken voor patiënten met bloedziekten zoals leukemie, 3), assisteren optimalisering van fluorescentie-activated flow Cytometry protocollen die gebruik maken van verse hele BM.
In de afgelopen decennia, Cytometry methoden zijn een krachtig instrument om het hematopoietische systeem te onderzoeken in de BM. Deze methodes omvatten fluorescentie-geactiveerde Stroom Cytometry en de nieuwe methode van CyTOF gebruikend zware metaal-geëtiketteerde antilichamen. Ze hebben geleid tot ontdekkingen van vele soorten cellen in een heterogene biologisch specimen door identificatie van hun unieke oppervlakte marker expressieprofielen. Verhoogde spectrum overlappingen die geassocieerd zijn met meer kanalen leidt tot hogere gegevens onnauwkeurigheid in fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen. Daarom worden ongewenste cellen routinematig verwijderd om de cel populaties van belang te verrijken voor fluorescentie-activated flow Cytometry analyse. Bijvoorbeeld, Ly6G (of GR-1) en CD11b worden beschouwd als volwassen myeloïde Cell markers en Ly6G+ (of GR-1+) en CD11b+ cellen worden routinematig verwijderd uit BM monsters met behulp van magnetische verrijking kits voorafgaand aan flow Cytometry analyse van hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) of door het combineren van deze markers in een dump cocktail kanaal1,2,3. Een ander voorbeeld is dat neutrofielen routinematig uit menselijk bloed specimen worden verwijderd om perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor immunologische studies te verrijken. Hele beenmerg geïsoleerd van de muis of de mens, echter, is zelden onderzocht intact voor Cytometry analyse.
Onlangs is CyTOF een revolutionair hulpmiddel geworden om het hematopoietische systeem4,5,6te onderzoeken. Met CyTOF, worden de fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vervangen door zwaar element reporter-geëtiketteerde antilichamen. Deze methode maakt het mogelijk voor de meting van meer dan 40 markers gelijktijdig zonder de zorg van het spectrum overlap. Het heeft de analyse van intact biologisch specimen zonder pre-uitputtings stappen of een stortplaats kanaal toegelaten. Daarom kunnen we het hematopoietische systeem uitvoerig bekijken met een hoge-inhoud dimensionaliteit van conventionele 2-D flow Cytometry percelen. Cel populaties weggelaten in het verleden tijdens uitputting of gating proces kan nu worden gebracht in het licht met de High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF4,5. We hebben een antilichamen paneel ontworpen dat gelijktijdig 39 parameters in het hematopoietische systeem meet met een focus op de myeloïde linage7. Vergeleken met de conventionele flow Cytometry gegevens, de interpretatie en visualisatie van de ongekende single-cell High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF is een uitdaging. Computationele wetenschappers hebben ontwikkeld dimensionaliteit reductie technieken voor de visualisatie van High-dimensionale datasets. In dit artikel, gebruikten we het algoritme, viSNE, die t-Distributed stochastische buurman inbedding (t-GND) techniek gebruikt om de CyTOF gegevens te analyseren en om de High-dimensionale resultaat presenteren op een 2-dimensionale kaart, terwijl het behoud van de High-dimensionale structuur van de gegevens8,9,10. Op de tSNE plot worden soortgelijke cellen gegroepeerd in subsets en de kleur wordt gebruikt om de functie van de cellen te markeren. Bijvoorbeeld, op Figuur 1 worden de myeloïde cellen verdeeld in meerdere cel subsets gebaseerd op de gelijkenissen van hun expressie patronen van 33 oppervlakte markers vloeide voort uit CyTOF (Figuur 1)4. Hier hebben we onderzocht muis beenmerg met onze eerder gemelde 39-marker CyTOF panel door viSNE Analysis7. viSNE analyse van onze CyTOF gegevens bleek een niet-geïdentificeerde cel populatie die zowel HSPC (CD117+) en neutrofiele (Ly6G+) kenmerken (Figuur 2)7toonde.
Samenvattend, presenteren wij een protocol om vers geheel beenmerg voor CyTOF analyse te verwerken. In dit artikel, gebruikten we muis beenmerg als een voorbeeld, terwijl dit protocol kan ook worden gebruikt voor het verwerken van menselijk beenmerg monsters. De details die specifiek zijn voor het menselijk beenmerg monsters zijn ook vermeld in het protocol als goed. Het voordeel van dit protocol is dat het Details zoals incubatietijd en temperatuur bevat die werden geoptimaliseerd om neutrofiele-Lineage cellen in het gehele beenmerg te bewaren om onderzoek op het intacte gehele beenmerg toe te laten. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen.
In de afgelopen decennia, fluorescentie-based flow Cytometry werd gebruikt als de belangrijkste methode om cellulaire lineages en heterogeniteit1,2,3studie. Hoewel flow Cytometry heeft multi-dimensionale gegevens, deze methode is beperkt door keuzes van parameters en spectrale overlap. Om de zwakheid van Stroom Cytometry te overwinnen namen wij voordeel van CyTOF, die zware metaal isotopen in plaats van fluorophores gebruikt om …
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de LJI flow Cytometry core bedanken voor hulp bij de massa Cytometry procedure. Dit werk werd gesteund door NIH verleent R01HL134236, P01HL136275, en R01CA202987 (allen aan C. C. H) en ADA7-12-MN-31 (04) (aan C.C.H. en Y. P. Z).
CyTOF Antibodies (mouse) | |||
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
Experimental Model: Organism/Strains | |||
Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
Software Alogrithm | |||
Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |