Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado
Summary
O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.
Abstract
Descrito aqui é um protocolo PCR-baseado para genótipo o embrião do estágio do gástrula do vectensis cnidários cnidários do nematostella sem sacrificar a vida do animal. Após a fertilização in vitro e de-jellying, zigítos são autorizados a desenvolver por 24 h à temperatura ambiente para chegar ao estágio inicial-a meados de gastrula. Os embriões do gástrula são coloc então em uma cama do gel do agarose em um prato de Petri que contem o seawater. o microscópio de dissecação, uma agulha de tungstênio é usada para separar cirurgicamente um fragmento de tecido aboral de cada embrião. Os embriões pós-cirúrgicos são então autorizados a curar e continuar o desenvolvimento. O DNA de Genomic é extraído do fragmento isolado do tecido e usado como um molde para o PCR locus-específico. O genótipo pode ser determinado com base no tamanho dos produtos de PCR ou presença/ausência de produtos de PCR alelo-específicos. Os embriões pós-cirúrgicos são então ordenados de acordo com o genótipo. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4 – 5 h. Este método pode ser usado para identificar mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de embriões e permite análises de fenótipos durante o desenvolvimento.
Introduction
Os cnidarians representam um grupo diverso de animais que incluem Medusa, corais, e Anemones de mar. São diploblastos, compostos por ectoderma e endoderma que são separados por uma matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria é um grupo de irmãs a especiosos Bilateria, a que os modelos animais tradicionais tais como a Drosophila e o Mus pertencem1. Além disso, pensa-se que a divergência Cnidaria-Bilateria ocorreu no período pré-cambriano2. Como tal, estudos comparativos de cnidários e bilaterianos são essenciais para obter insights sobre a biologia de seu ancestral comum mais recente. Recentemente, a genômica comparativa revelou que os cnidários e os bilaterianos compartilham muitos genes de kit de ferramentas de desenvolvimento, como notch e bhlh, implicando que seu ancestral comum já tinha esses genes3. Entretanto, o papel destes genes desenvolventes do Toolkit no último antepassado comum de Cnidaria e de Bilateria é comparàvel menos bem compreendido. Para abordar este problema, é crítico estudar como estes genes profundamente conservados funcionam em cnidarians.
Um dos modelos genéticos cnidários emergentes é o cnidários nematostella vectensis. Seu genoma foi seqüenciado3, e uma variedade de ferramentas genéticas, incluindo o knockdown do gene morpholino-negociado, o transgenesis meganuclease-negociado, e as knockins e os Knockouts do gene de Crispr-Cas9-negociados, estão agora disponíveis para o uso neste animal. Além disso, o desenvolvimento de Nematostella é relativamente bem compreendido. Durante a embriogênese, a gastrulação ocorre pela invaginação4, e o embrião se desenvolve em uma larva de Planula de natação livre. A Planula posteriormente se transforma em um pólipo séptil com uma boca e tentáculos circunorais. O pólipo cresce e atinge a maturidade sexual.
A mutagenese segmentada por crispr-Cas9 é agora rotineiramente utilizada para estudar a função gênica em nematostella vectensis5,6, 7,8,9. Para gerar mutantes Knockout em Nematostella, um coquetel contendo RNAs de guia único Locus-específicos e a proteína de endonuclease Cas9 é injetado pela primeira vez em ovos não fertilizados ou fertilizados para produzir animais fundadores da F0 que tipicamente mostram mosaicism. Os animais F0 são subsequentemente levantados para a maturidade sexual e cruzados uns com os outros para produzir uma população de F1, um subconjunto do que pode ser mutantes Knockout6. Alternativamente, os animais de F0 sexualmente maduros podem ser cruzados com animais do tipo selvagem para gerar animais heterozigotos F1, e os heterozygotes F1 que carregam um alelo de nocaute no locus de interesse podem então ser cruzados uns com os outros para produzir descendentes de F2, um quarto dos quais são esperados para ser mutantes Knockout5. Ambas as abordagens requerem um método para identificar mutantes de nocaute de uma população geneticamente heterogênea. Os tentáculos de pólipo podem ser usados para extrair o DNA genómico para a genotipagem6,7. No entanto, nos casos em que a função de desenvolvimento do gene de interesse está sendo investigada e os embriões mutantes não atingem o estágio pólipo (isto é, devido à letalidade larval associada à mutação), os mutantes Knockout precisam ser identificados precocemente na ontogenia. É descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo animais individuais no estágio do gástrula sem sacrificar o animal, que permite a identificação de mutantes do Knockout de uma população genetically heterogênea dos embriões. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo um único embrião do Anemone de mar sem sacrificar o animal. Depois de desova e de-jellying, os ovos fertilizados são autorizados a desenvolver-se em gastrulae. A região aboral de cada embrião do gástrula é removida cirùrgica, e o tecido aboral isolado é usado para a extração genomic subseqüente do ADN, quando os embriões restantes da borne-cirurgia curarem e continuarem o desenvolvimento. Os extratos de gDNA são usados então para um ensaio do PCR para d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos revisores anônimos por comentários sobre a versão anterior do manuscrito, que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos da Universidade de Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. 발생학. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. 발생학. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. 발생학. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
