Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.
Abstract
Beschrieben ist hier ein PCR-basiertes Protokoll, um den Gastorula-Stadium-Embryo des anthozoischen cnidären Nematostella vectensis zu genotypisieren, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Nach In-vitro-Fertilisation und Enthaarung dürfen sich Zygoten für 24 h bei Raumtemperatur entwickeln, um das Früh- bis Mittelgastrulastadium zu erreichen. Die Gastorula-Embryonen werden dann auf einem Agarose-Gelbett in einer Petrischale mit Meerwasser platziert. Unter dem Sezieren des Mikroskops wird eine Wolframnadel verwendet, um ein Aboralgewebefragment von jedem Embryo operativ zu trennen. Embryonen nach der Operation dürfen dann heilen und weiterentwickelt werden. Genomische DNA wird aus dem isolierten Gewebefragment extrahiert und als Vorlage für die ortsspezifische PCR verwendet. Der Genotyp kann anhand der Größe von PCR-Produkten oder des Vorhandenseins/Fehlens von allelespezifischen PCR-Produkten bestimmt werden. Nachderinwerden von Embryonen wird dann nach dem Genotyp sortiert. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gescreenen Embryonen ab, erfordert aber minimal 4–5 h. Diese Methode kann verwendet werden, um Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen zu identifizieren und ermöglicht Analysen von Phänotypen während der Entwicklung.
Introduction
Die Cnidarians repräsentieren eine vielfältige Gruppe von Tieren, die Quallen, Korallen und Seeanemonen umfassen. Es handelt sich um Diploblasten, die aus Ektoderm und Endoderm bestehen und durch eine extrazelluläre Matrix (Mesoglea) getrennt sind. Cnidaria ist eine Schwestergruppe zur Speziiose Bilateria, zu der traditionelle Tiermodelle wie Drosophila und Mus gehören1. Zusätzlich wird angenommen, dass die Divergenz Cnidaria-Bilateria in der vorkambrischen Periode2aufgetreten ist. Als solche sind vergleichende Studien an Cnidarians und Bilaterianern unerlässlich, um Einblicke in die Biologie ihres jüngsten gemeinsamen Vorfahren zu gewinnen. Kürzlich hat die vergleichende Genomik gezeigt, dass Cnidarians und Bilaterianer viele Entwicklungs-Toolkit-Gene wie Kerb und bHLH teilen, was impliziert, dass ihr gemeinsamer Vorfahrbereitsen diese Gene hatte3. Die Rolle dieser Entwicklungs-Toolkit-Gene im letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria ist jedoch vergleichsweise weniger gut verstanden. Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig zu untersuchen, wie diese tief konservierten Gene bei Cnidarians funktionieren.
Eines der aufkommenden cnidarian genetischen Modelle ist die anthozoanE Nematostella vectensis. Sein Genom wurde3sequenziert, und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen, einschließlich Morpholino-vermittelter Genknockdown, Meganuklease-vermittelte Transgenese und CRISPR-Cas9-vermittelte Genknockins und Knockouts, sind jetzt für den Einsatz in diesem Tier verfügbar. Darüber hinaus ist die Nematostella-Entwicklung relativ gut verstanden. Während der Embryogenese tritt die Gastrulation durch Invagination4auf und der Embryo entwickelt sich zu einer freischwimmenden Planulalarve. Die Planula verwandelt sich anschließend in einen sessilen Polypen mit Mund und umlaufenden Tentakeln. Der Polypen wächst dann und erreicht die Geschlechtsreife.
CRISPR-Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird jetzt routinemäßig verwendet, um die Genfunktion in Nematostella vectensis5,6,7,8,9zu untersuchen. Zur Erzeugung von Knockout-Mutanten in Nematostellawird ein Cocktail mit lokusspezifischen Ein-Guide-RNAs und dem Endonuklease-Cas9-Protein zunächst in unbefruchtete oder befruchtete Eier injiziert, um F0-Gründertiere zu produzieren, die typischerweise Mosaik. F0-Tiere werden anschließend zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt, um eine F1-Population zu erzeugen, von denen eine Teilmenge Knockout-Mutanten6sein kann. Alternativ können geschlechtsreife F0-Tiere mit Wildtieren gekreuzt werden, um F1-Heterozygoten zu erzeugen, und F1-Heterozygoten, die ein Knockout-Allel im Ort des Interesses tragen, können dann miteinander gekreuzt werden, um F2-Nachkommen zu produzieren, ein Viertel von denen erwartet werden, knockout mutants5sein. Beide Ansätze erfordern eine Methode zur Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population. Polyp Tentakel können verwendet werden, um genomische DNA für genotypisieren6,7zu extrahieren. In Fällen, in denen die Entwicklungsfunktion des Gens untersucht wird und mutierte Embryonen das Polypenstadium nicht erreichen (d. h. aufgrund der mit der Mutation verbundenen Larventoalität), müssen Knockout-Mutanten früh in der Ontogenidentifizierten identifiziert werden. Hier wird ein PCR-basiertes Protokoll beschrieben, um einzelne Tiere im Gastrulastadium zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern, was die Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen ermöglicht. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gesiebenden Embryonen ab, erfordert aber minimal 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrieben hier ein PCR-basiertes Protokoll, um einen einzelnen Seeanemonen-Embryo zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern. Nach dem Laichen und Entgelten dürfen sich die befruchteten Eier zu Gastrulae entwickeln. Die aborale Region jedes Gastorula-Embryos wird operativ entfernt, und das isolierte Aboralgewebe wird für die nachfolgende genomische DNA-Extraktion verwendet, während die verbleibenden postoperativen Embryonen heilen und die Entwicklung fortsetzen. Die gDNA-Extrakte werden dann für einen PCR-Test verw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken anonymen Rezensenten für Kommentare zur früheren Version des Manuskripts, die das Manuskript verbessert hat. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der University of Arkansas unterstützt.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
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