JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

שיטה זו מספקת מסגרת ללימוד שילוב של חומצות שומן אקסוגני ממקורות מארחים מורכבים לקרומים חיידקיים, בעיקר סטייהילוקוקוס. כדי להשיג זאת, פרוטוקולים עבור העשרת ליפופרוטאין חלקיקים מחלמון ביצת עוף ובעקבות הפרופיל חומצות שומן לאחר מכן של פוספוליפידים חיידקיים ניצול ספקטרומטר מסה מתוארים.

Abstract

לשלב את חומצות השומן מהסביבה לתוך ממברנה פוספוליפידים. במהלך הזיהום, רוב חומצות השומן האקסוגני נמצאים בתוך ליפופרוטאין חלקיקים מארחים. חוסר ודאות נשאר באשר למאגרים של חומצות שומן מארח ומנגנונים שבהם חיידקים לחלץ חומצות שומן מן החלקיקים ליפופרוטאין. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים עבור העשרה של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) חלקיקים מחלמון ביצת עוף ולקבוע אם LDLs לשמש מאגרים חומצות שומן עבור האוראוס. שיטה זו מנצלת ניתוח lipidomic משוחדת ו LDLs עוף, מודל יעיל וחסכוני לחקר האינטראקציות בין LDLs וחיידקים. הניתוח של האינטגרציה האורבית של חומצות שומן אקסוגני מ LDLs מבוצע באמצעות ברזולוציה גבוהה/מדויק מאוד ספקטרומטריה ומדויקת ספקטרומטר מסה, המאפשר אפיון של הרכב חומצת שומן של החיידק קרום וזיהוי משוחדת של שילובים הרומן של חומצות שומן העולות ליפידים ממברנה חיידקי לאחר החשיפה LDLs. אלו טכניקות מתקדמות הספקטרומטר מסה להציע פרספקטיבה שאין כמוה של התאגדות חומצת שומן על ידי חשיפת חומצות שומן מסוימות האקסוסוגני שולבו הפוספוליפידים. השיטות המפורטות כאן הם להתאמה למחקר של פתוגנים חיידקיים אחרים ומקורות חלופיים של חומצות שומן מורכבות.

Introduction

סטפילוקוקוס-עמיד S. האוראוס (MRSA) הוא הגורם המוביל לזיהום הקשורות לבריאות הקשורים ועמידות לאנטיביוטיקה הקשורים הוא אתגר קליני ניכר1,2,3. לכן, ההתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן הוא בעדיפות גבוהה. אסטרטגיה לטיפול מבטיח פתוגנים גראם חיוביים היא סינתזה חומצת שומן מעכב, דרישה הייצור פוספוליפיד הממברנה, ב -S.האורמית, כולל זרחן (PG), ליצ-PG, ו-cardiolipin4. ב חיידקים, הייצור חומצת שומן מתרחשת באמצעות מסלול החומצות שומן סינתזה השני (פאפסי)5, אשר שונה באופן משמעותי מעמיתו איקריוטית, עושה fasii טרה אטרקטיבית לפיתוח אנטיביוטי5,6 . מעכבי FASII בעיקר היעד FabI, אנזים הדרוש חומצת שומן התארכות שרשרת פחמן7. Triclosan המדכא משמש באופן נרחב במוצרי הצרכן והרפואי8,9. מעכבי fabi נוספים מפותחים על ידי חברות תרופות מספר לטיפול בזיהום האוראוס10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. עם זאת, הרבה פתוגנים גראם חיוביים, כולל S.האוראוס, מסוגלים לניקוי חומצות שומן אקסוגני עבור סינתזה פוספוליפיד, לעקוף את העכבות האלה27,28,29. לפיכך, הפוטנציאל הקליני של מעכבי פאג’י הוא דיון בשל פערים ניכרים בידע שלנו על מקורות של חומצות שומן מארח ומנגנונים שבהם פתוגנים לחלץ חומצות שומן מן המארח27,28. כדי להתמודד עם הפערים האלה, פיתחנו lipidomic ניתוח שיטה משוחדת לפקח על שילוב של חומצת שומן אקסוגני מן ליפופרוטאין חלקיקים לתוך פוספוליפידים קרום של האוראוס.

במהלך אלח דם, ליפופרוטאין חלקיקים מארחים מייצגים מקור פוטנציאלי של חומצות שומן נגזרות מארח בתוך ואצלב, כרוב חומצות שומן מארח משויכים החלקיקים30. ליפורופנס מורכב פגז ידרופילי מורכב של פוספוליפידים וחלבונים התוחמים ליבת הידרופובי של טריגליצרידים ואסטרים כולסטרול31. ארבעה כיתות גדולות של ליפופרוטאינים-chylomicron, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד, ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה, וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) — מיוצרים על ידי המארח והפונקציה כמו כלי רכב הובלה ליפיד, אספקת חומצות שומן וכולסטרול אל ומ תאים מארחים באמצעות הכלי ואצלב. LDLs הם בשפע חומצת שומן esterified כולל טריגליצרידים ואסטרים כולסטרול31. בעבר הדגמנו כי LDLs אנושי מאוד מטוהרים הם מקור בר קיימא של חומצות שומן אקסוגני לסינתזה PG, ובכךלספק מנגנון עבור מעכבי fasii לעקוף את ה32. טיהור אנושי LDLs יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית זמן רב בעוד מקורות מסחריים של LDLs האדם מטוהרים הם יקרים מאוד לשימוש על בסיס שגרתי או לבצע מסכי חיידקי בקנה מידה גדול. כדי לטפל במגבלות אלה, שינו הליך להעשרה של LDLs מחלמון ביצת עוף, מקור עשיר ליפופרוטאין חלקיקים33. השתמשנו בהצלחה בספקטרום לא ממוקד, ברזולוציה גבוהה/מדויקת בספקטרומטר מסה ובספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לפקח על השילוב של חומצות השומן האנושיות הנגזרות LDL לתוך הקרום של S. האוראוס32. שלא כמו שיטות שדווחו קודם לכן, גישה זו יכולה לכמת חומצות שומן בודדות איזוers עבור כל אחד משלושת הסוגים העיקריים של פוספולילוטופיד זרחן. חומצה אולאית (18:1) היא חומצת שומן בלתי רווי בתוך כל חלקיקי ליפופרוטאין, כי הוא שולב בקלות לתוך S. האורליפידים פוספוליפיפיחלקיקים29,30,32. S. האוראוס אינו מסוגל לסינתזה חומצה אולאית29; לכן, כמות של פוספוליפיד משולב חומצה אולאית קובע את הנוכחות של ליפופרוטאין מארחים-חומצות שומן נגזרות בתוך קרום ממברנה משולבת29. אלה מינים פוספוליפיד יכול להיות מזוהה על ידי המדינה-of-the-אמנות השיטה הספקטרומטר המסה תיאר כאן, מציע ברזולוציה חסרת תקדים של הרכב הקרום של האוראוס תרבותי בנוכחות של מקור חומצת שומן זה סביר נתקלת בזמן ההדבקה.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא להעשרת חלקיקי LDL מחלמון ביצת עוף נגזר מוסא ואח ‘ 200233. 1. הכנת חלמון ביצת עוף להעשרת חלקיקי LDL באמצעות שטיפת הפגזים עם התמיסה 70% אתנול והתרת האוויר ליבשה, מייבשים שתי ביצי עוף גדולות. בעזרת התמיסה של 70% אתנול. ואפשר לייבש את האוויר הצמד ?…

Representative Results

הפרוטוקול להעשרת ה-LDL מחלמון ביצת עוף מומחש באיור 1. תהליך זה מתחיל על ידי לדלל חלמון ביצה שלמה עם מלוחים והפרדת מוצקים חלמון ביצה המכונה גרגירים מן השבר מסיס או פלזמה המכיל את LDLs (איור 1)33. תוכן ה-LDL של השבר פלזמה מועשר עוד יותר ע?…

Discussion

S. האוראוס משלבת חומצות שומן אקסוגני לתוך ממברנה פוספוליפידים27,32,43. סינתזה פוספוליפיד באמצעות חומצות שומן אקסוגני עוקף פפסי עיכוב אבל גם משנה את המאפיינים ביופיזיים של הממברנה27,32,44….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי המעבדה האמר על הערכה קריטית של כתב היד ותמיכה בעבודה זו. ד ר אלכס הורביץ מאוניברסיטת קולורדו בית הספר לרפואה סיפק AH1263. ד ר. כריס ווטרס מעבדה באוניברסיטת מישיגן סטייט סיפק ריאגנטים. עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקאי הענקת 16SDG30170026 וכספים האתחול לספק על ידי אוניברסיטת מישיגן סטייט.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image