利用人类诱导的多能干细胞衍生的肠道有机体研究和改性上皮细胞对沙门氏菌和其他病原体的保护

1. 诱导多能干细胞的培养和转移 请注意:这里描述的所有方法都使用市售的人类细胞系。下面详述的所有组织培养工作都应在 II 类层流罩中完成。根据制造商的说明, Ipsc 通常在干细胞培养基中进行维护 (见材料表), 从而使 Ipsc 能够无周培养。Ipsc 可以相对轻松地从其他 iPSC 培养系统进行调整。 一旦菌落覆盖了大约 80%-90% 的板表面, 细胞就会通过。 在使用前1小时准备通道板, 在组织培养处理的板材中加入在 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS; 无钙 [Ca] 或镁 [Mg]) 中稀释的 vitronectin 10Μg/ml。涂层的体积取决于板材尺寸, 可在制造商的说明中找到。在此期间, 温暖的干细胞培养基到室温 (RT)。 从准备通过的 Ipsc 中取出介质, 并用 DPBS 清洗细胞 2倍 (不含钙或镁)。 在板材中添加 EDTA 解决方案 (参见材料表), 确保整个表面被涂覆并在 rt 孵育5-8分钟。当 iPSC 菌落中心开始出现孔时, 吸气并丢弃 EDTA 解决方案。 在井中加入干细胞培养基;将 Ipsc 通过在板面上轻轻清洗介质几次来取出。Ipsc 是作为团块而不是单个单元进行传递的, 因此请确保 EDTA 解决方案不会持续太长时间。将任何脱落的 Ipsc 移动到15毫升的锥形管。 从预涂板中吸出玻璃体被锡, 并以干细胞培养基代替。多次反转 iPSC 悬架, 以确保 Ipsc 没有在锥形管的底部沉淀, 并添加适当体积的悬浮液, 使新的盘子上的细胞稀释1:10。拆分率可能会根据 iPSC 的增长率进行调整, 而 iPSC 线路之间的增长率可能会有所不同。 将板材摇一摇, 将 Ipsc 分散在表面, 并将其放置在 37°c% Co-2的孵化器中。在传代后的第二天给 Ipsc 喂奶。 2. 从 Ipsc 到信古特的区别 在第0天, 将 Ipsc 分成10厘米的组织培养处理盘, 如步骤1.2 所述, 用玻璃体被原涂成 vitronectin, 分成 10 ml 的干细胞培养基, 辅以活性蛋白 a (10 ngml) + 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF; 12 ngml)。在使用前将生长因子直接添加到介质中;在所有后续步骤中执行此操作。 第1天, 改变培养基 (10 毫升的干细胞培养基与活性蛋白 a [10 ngml] + bfgf [12 ngml])。 在第2天, 开始分化, 将培养基改为10毫升的干细胞培养基, 并辅以以下生长因子: 活性蛋白 a (100 ng/ml)、Bfggf (100 ngml)、骨形态发生蛋白 4 (bFGF; 10 ng/ml)、磷酸肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 (10μm) 和 GSK3 抑制剂 CHR99021 (3μm)。 第3天, 将培养基改为10毫升的干细胞培养基, 辅以活性蛋白 a (100 ngml)、bfgf (100 ngml)、bFGF (10ngml) 和 y294002 (10μm)。这种介质诱导的内皮规范应导致在接下来的24小时内 iPSC 菌落形态发生明显变化。 第4天, 将培养基改为10毫升的 RPMI/B27 介质, 辅以活性蛋白 a (100 ngml) 和 bfgf (100 ngml)。请注意:RPMI/B27 培养基含有500毫升 RPMI 培养基, 含 l-谷氨酰胺补充剂 (见表 1)、b27 补充剂10毫升 (50x, 不含血清) 和5毫升非必需氨基酸。可选: 添加5毫升青霉素链霉素 (10, 000 u l)。使用前进行过滤消毒。 第5天, 将培养基改为10毫升的 RPMI/27 介质, 并辅以活性蛋白 a (50 ng/ml)。 在第6天, 开始将后部的后部内皮模式改变为 RPMI\ b27 培养基的 10ml, 再加上 chir99021 (6μm) + 维甲酸 (3μm)。 在第7、 8和9天, 重复步骤2.7。在这些步骤中, 后肠的可见三维结构应该会变得明显, 覆盖在板的表面。 在第10天, 将产生的后肠嵌入地下室膜基质中 (参见材料表)。 3. 在基底膜基质中嵌入下肠 组成 iHO 基地增长媒体 (500 毫升的先进杜尔贝克的修改鹰的媒体 [DMEM]/F12, B27 补充剂10毫升 [50x, 无血清], N2 补充剂5毫升 [100x, 无血清], 5 毫升 1 mL-(2-羟乙基)-1-吡嗪磺酸 (HEPES), 和5毫升的非必需氨基酸 [100x]。可选: 添加5毫升青霉素链霉素 [10, 000 U/mL];使用前进行过滤消毒。见表 1)。 从后肠板上取出介质, 用 DPBS 清洗 1 x 的介质 (不含 Ca 或 Mg)。在板上加入5毫升胶原酶溶液, 在37°c 孵育5分钟。 将500毫克胶原酶 IV 粉加入400毫升的先进 DMMS/F12 中, 生产胶原酶溶液。接下来, 加入100毫升的血清置换剂 (见材料表)、5毫升的 l-谷氨酰胺 (200 mm) 和3.5μl 的 2-硫醇, 并旋流溶液混合。一旦胶原酶粉末完全溶解, 对溶液进行过滤消毒。请注意:这可以在-20°c 下储存长达 6个月, 在较小的等价物中。 通过在板中加入5毫升的 iHO 基部生长介质, 并使用细胞刮刀刮掉后肠细胞, 在15毫升锥形管中收集后肠悬浮液, 从而激活胶原酶。 以 240 x g 离心 1分钟 , 上清液下移液器。 加入10毫升介质, 轻轻移液将后肠分解成较小的块, 并以 95 x g 的速度再次离心1分钟。 通过重复步骤 3.5, 在 iHO 基生长介质中清洗细胞2倍。将细胞重新注入少量的碱基生长介质 (~ 300-500Μl), 并将该溶液的约100Μl 添加到 1.5 mL 的基底膜基质中。在这段时间里, 基质必须停留在冰上, 因为它将在 RT 开始快速凝固。 在37°c 的板加热器上设置一个24孔板, 并将60Μl 发现到24孔板的一个井中。让它短暂设置, 并在显微镜下检查密度。 如果需要, 以增量的方式在基底膜基质中添加更多的后肠溶液, 直到达到所需的浓度, 并将溶液发现到剩余的井中。 在37°c 下孵化 10分钟;然后, 在24井板的每口井中加入800μl 的 iHO 基生长介质, 在以下浓度下添加生长因子 (见表 1): 500 ngml r-boadine-1, 100 ngml noggin, 100 ngml 表皮生长因子 (egf), 3ΜM chir99021, 2.5μm前列腺素 E2 和 10μm y-27632 一水 (ROCK 抑制剂)。 每2-3天更改一次 iHO 基生长介质, 如果介质开始变色, 则立即更改。在最初播种到基底膜基质后, 让 Iho 发育 7天, 然后将其分裂。到第3-4 天, 不同的球体应该在文化中可见。 仅对于介质更改, 请省略 Y-27632, 因为这只在分裂/播种时需要。 4. Iho 的维护和通过 为了允许逐渐解冻, 在裂开前 24小时, 在4°c 的冰桶中, 在裂隙前 24小时, 将所需体积的基底膜基质放在覆盖的冰桶中。 从 Iho 中取出介质, 每口用500μl 的细胞提升液 (参见材料表) 代替介质。在4°c 下孵化 40-50分钟, 此时 Iho 应漂浮在溶液中。 可选: 使用引擎盖成像系统仅选择具有所需形态的 Iho (参见材料表)。 轻轻将 iHO/cell 提升液悬浮到15毫升锥形管中, 尽量不将 Iho 拆散。让 Iho 沉淀 3-5分钟, 取出上清液和单细胞。 将 iHO 基培养基5毫升中的 Iho 重新拔回, 轻轻将其移液清洗。以 95 x g 离心 2分钟 。 在引擎盖内37°c 的板加热器上设置一个24孔板。 去除上清液, 并在 ~ 300-500μl 的基础生长介质中重新悬浮 Iho, 使用 P1000 移液器将 Iho 分解成较小的块。请注意, 需要应用的力将根据 iHO 线和成熟状态而有所不同, 因此请轻轻开始, 在需要时增加力。 将约100Μl 的 Iho (体积取决于溶液的密度) 放入基底膜基质的 1.5 mL 中, 并将移液器短暂混合。 将基底膜基质的1×60μl 发现24孔板的一个井, 使其凝固约 30秒, 然后在显微镜下检查密度。如果密度太低, 则在矩阵中添加更多的 Iho。 重复步骤 4.8, 直到获得正确的密度, 然后将矩阵的其余部分发现为24孔板。 将其放置在37°c 的孵化器中 10分钟, 然后用800μl 的基础生长介质覆盖它, 并具有生长因子, 如步骤3.7 所述。 为了准备 Iho 的入侵试验 (概述如下), 通过 iho 实验前4-5天如步骤4.1-4.10 中所述, 但放置120μl 的基质 iHO 溶液产生到5毫米玻璃底微注射盘。 与其把 iHO 悬浮液放在一个带有常规传递的液滴中, 不如将液滴铺在盘子的底部, 形成一层薄薄的矩阵。用2.5 毫升的基础生长培养基加生长因子覆盖它。请注意:如果抗生素已在培养基中使用, 则必须将其去除, 代之以用于微注射实验的非抗生素补充培养基。 5. 用 rhIL-22 对 Iho 进行刺激 在入侵试验前18小时将介质从 Iho 中吸收, 并将其替换为新鲜的碱基生长培养基 (不得含有抗生素)。 在培养基中加入 rhIL-22, 最终浓度为 100 ngml。 6. 微注射 Iho 和细胞内入侵检测 在实验的前一天, 设置s。在卢里亚-伯谷汤10毫升培养, 并在37°c 孵育与晃动。 在实验当天, 如果有带有封闭热室的显微镜, 请将其打开, 并在开始检测之前使温度达到37°c。 将 DPBS 中的隔夜细菌培养物 (含钙和镁) 稀释至2至600纳米 (OD600) 的光学密度, 然后将其与苯酚红色混合1:1。 将含有 Iho 的微注射盘加载到显微镜下, 取下盖子, 并将 Iho 聚焦, 准备开始注射。 打开喷射器和手臂控制站。确保喷油器设置为600千帕的压力和0.5秒的喷射时间。如果它还没有从显微镜阶段退去, 旋转注射臂, 以确保它是。 通过从针头上取下包装和塑料筒, 设置6μm 微注射钻头。从注射臂上取下手柄头。 用接种器的10Μl 装入钻头, 轻轻抓住钻头的钝端。将钻头放在手柄头上, 然后将其重新连接到微注射臂上。 轻轻地将手臂移动到位置, 使针头位于微注射盘上方1-2 厘米处。使用手臂控制将针尖放置在盘子的中心, 并将其降低, 直到它刚刚超过介质表面。 在所有注射后, 编程手臂控制站将针头返回到这一点。 将显微镜对准 Iho, 然后选择要注射的目标。将针头放置在要注射的 iHO 的正上方和右侧, 并将针头向下和侧向移动到 iHO 流明中。 按下微喷射器上的注射按钮;被酚状染色的细菌混合物会从针头中出现。注入每个 iHO 3x。每个条件至少注入 30个 Iho。请注意:由于一个培养体内的 iHO 的大小和结构的异质性, 有必要注入大量的 Iho 来控制变化。 当所有必需的 Iho 被注入时, 将微注射板从舞台上取出, 更换盖子, 并在37°c 下孵育板90分钟。 90分钟后, 吸入生长介质, 代之以3毫升的细胞提升液;在4°c 孵育45分钟。 轻轻地将 Ihos/细胞提升溶液移动到含有5毫升 DPBS 的 15 mL 锥形管。确保所有注射的 Iho 都已从盘子中取出 (如有需要, 请用 DPBS 的1毫升冲洗板)。在 370 x g离心3分钟。 在 0.1 Mg/ml 时取出上清液并重新悬浮含有庆大霉素的基础生长介质中的 Iho (添加 1 mL 介质; 然后使用 P1000 移液器 ~ 50x 分解 Iho, 并添加4毫升的进一步培养基)。 在37°c 时孵化 1小时, 杀死细胞外细菌。 以 370 x g 离心 Iho 3分钟, 并吸入上清液, 留下的越少越好。用 DPBS 和离心机再次清洗 Iho 1x。请注意:这一步去除庆大霉素, 这一点很重要, 因为任何剩余的庆大霉素一旦细胞被裂解, 都可能杀死细胞内细菌。 在500μl 的裂解缓冲液中重新使用 Iho (见材料表), 并通过移液 ~ 50x 手动分离有机体。将此混合物在 RT 停留5分钟。 在 DPBS 中将产生的溶液串行稀释 10倍, 产生10-fold、10-fold和10-fold 浓度. 将整齐和稀释的溶液滴入预热的 lb 琼脂板上的液滴3X20μl 液滴。 在37°c 下过夜, 对菌落形成单位 (CFU) 进行菌落计数和计算。菌落计数将反映细胞内细菌的数量, 这些细菌是在细胞裂解过程中释放的。 7. 细胞冻结和恢复 请注意:如前所述, 有可能在低温保存 Iho 并在需要时对其进行重组。冻结和解冻过程概述如下。 选择要冻结的 Iho 井。将细胞提升液添加到井中, 在4°c 下孵育40-50分钟。Iho 应该漂浮在解决方案中。 轻轻将 Iho 移入15毫升的锥形管, 使其安顿下来。取出介质, 用基础生长介质清洗 Iho 1x (无生长因子)。 以 95 x g离心 2分钟, 取出上清液, 并将其替换为适当体积的细胞冷冻介质 (见《材料表》; 按照制造商的说明使用该介质), 将 iho 分解成低温小瓶。 将小瓶存放在-80°c 的冰柜中过夜, 以便更逐步地冷冻;然后, 将它们转移到液氮储存。 要重建 Iho, 可在37°c 时使用水珠浴快速解冻低温小瓶;然后, 轻轻将其内容移入10毫升的基础生长介质 (无生长因子)。允许 Iho 将介质固定在约300μl 的新鲜基培养基中并将其替换。 不要手动离解 Iho。将 Iho 添加到基底膜基质中, 并按照第3节的描述将其装出。