Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.
Gelişimsel süreçte, embriyolar vücut boyutlarına karşı vücut desenlerini eşleştirmek için dikkat çekici bir yetenek sergiler; vücut orantısı, belirli sınırlar içinde daha büyük veya daha küçük olan embriyolarda bile korunur. Ölçekleme bu fenomen bir yüzyıl boyunca dikkat çekti rağmen, temel mekanizmaları anlamak, çeşitli boyutlarda embriyo gelişimsel dinamiklerin nicel açıklaması eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, in vivo canlı görüntüleme için büyük avantajlara sahip olan zebra balığı embriyolarının boyutunu cerrahi olarak azaltmak için yeni bir teknik geliştirdik. Biz ayrı adımlarla Blastula aşamasında hücrelerin ve sarısı dengeli kaldırılması sonra, embriyo hızlı bir şekilde doğru koşullar altında kurtarabilirsiniz ve daha küçük ama başka normal embriyolar içine geliştirmek olduğunu göstermektedir. Bu teknik özel ekipman gerektirmeyen bu yana, kolayca uyarlanabilir ve morphogen aracılı desen sağlamlık da dahil olmak üzere, ölçekleme sorunları geniş bir yelpazede çalışmak için kullanılabilir.
Bilim adamları uzun embriyo boyutu büyük ölçüde hem doğal ve deneysel koşullar altında değişebilir rağmen embriyoların sürekli vücut oranlarını oluşturmak için olağanüstü bir yeteneği var bilinen1,2,3. Onlarca yıl süren teorik ve deneysel çalışmalara rağmen, boyutsal varyasyona bu sağlamlık, ölçeklenme ve altta yatan mekanizmalar birçok doku ve organda bilinmiyor. Gelişmekte olan sistemin dinamiklerini doğrudan yakalamak için, zebra balığı4‘ te, in vivo canlı görüntüleme5‘ te büyük bir avantaja sahip olan tekrarlanabilir ve basit bir boyut azaltma tekniği kurduk.
Zebrafish, gelişim biyolojisi de dahil olmak üzere birden fazla biyoloji disiplininin çalışması için bir model vertebrat hayvanı olarak görev yapmıştır. Özellikle, zebra balığı in vivo canlı görüntüleme için idealdir6 çünkü 1) geliştirme normal anne ve yumurta kabuğu dışında devam edebilir, ve 2) embriyo saydamdır. Buna ek olarak, embriyolar bazı sıcaklık ve çevresel dalgalanmalara dayanabilir, bu da laboratuar koşullarında incelenmesini sağlar. Ayrıca, morpholino ve mRNA enjeksiyon7,8, Crispr/Cas9 teknolojisindeki son gelişmeler tarafından konvansiyonel gen ifadesi pertürasyon ek olarak yüksek verimli zebra balığı ters genetik yaptı9. Ayrıca, Embriyoloji birçok klasik teknikleri, hücre transplantasyonu veya doku cerrahisi gibi uygulanabilir4,10,11.
Boyut azaltma teknikleri ilk olarak amfitbiya ve diğer omurga dışı hayvanlar12‘ de geliştirilmiştir. Örneğin, Xenopus laevis, başka bir popüler omurgası hayvan modeli, blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca şekilde bölünmüş boyutu düşük embriyo üretebilir12,13. Ancak, bizim elimizde bu tek adımlı yaklaşım zebrafish içinde dorsalized veya ventriselleştirilmiş embriyolar, muhtemelen dorsal belirleyicileri düzensiz dağıtılır ve bir embriyolar morfolojisi kendi yerelleştirme bilmiyorum çünkü. Burada, normalde gelişmekte olan ama daha küçük embriyolar üreten zebra balığı için alternatif iki adımlı bir kesme tekniği gösterilmektedir. Bu teknik ile, hücreler ilk hayvan direği, organizatördeki aktivite eksikliği naif hücrelerin bir bölge kaldırılır. Epiboly ve sonraki morfojenler için önemli olan sarısı ve hücrelerin miktarını dengelemek için, sarısı daha sonra kaldırılır. Burada, bu protokolü ayrıntılarıyla ve desen oluşumunda boyut invaryans iki örnek sağlamak; Somit oluşumu ve ventral nöral tüp deseni. Nicel görüntüleme ile birlikte, Boyut azaltma tekniği, Somitlerin ve nöral tüp boyutlarının azaltılmış embriyolar boyutu nasıl etkilendiğini incelemek için kullandık.
Tarihsel olarak, omurgalı hayvanlar arasında, Boyut azaltma genellikle bir Blastula aşamasında hayvan-bitkisel eksen boyunca embriyolar bisecting tarafından, amfitiyomer embriyo kullanılarak yapılmıştır12. Ancak, biz embriyolar şehri ikiye bölüyor zaman kurbağa ve zebra balığı embriyo arasında ağırlıklı olarak iki fark vardır. İlk olarak, zebra balığı embriyoları bisi (Blastula aşaması) toleranslı olduğunda sahnede, organizatör Blastula…
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JPMJPR11AA) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01GM107733) PRESTO programı tarafından destekleniyordu.
60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
CaSO4 | For egg water | ||
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |