Summary

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen zu reduzieren, ohne die normalen Entwicklungsprozesse zu stören. Diese Technik ermöglicht das Studium der Musterskalierung und der Entwicklungsrobuste gegen Größenwechsel.

Abstract

Im Entwicklungsprozess weisen Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit auf, ihr Körpermuster an ihre Körpergröße anzupassen; Ihr Körperanteil wird auch bei Embryonen, die größer oder kleiner sind, innerhalb bestimmter Grenzen erhalten. Obwohl dieses Phänomen der Skalierung seit mehr als einem Jahrhundert Aufmerksamkeit erregt hat, ist das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen begrenzt, was teilweise auf die fehlende quantitative Beschreibung der Entwicklungsdynamik bei Embryonen unterschiedlicher Größe zurückzuführen ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir eine neue Technik entwickelt, um die Größe von Zebrafisch-Embryonen, die große Vorteile für die in vivo lebende Bildgebung haben, chirurgisch zu reduzieren. Wir zeigen, dass sich Embryonen nach einer ausgewogenen Entfernung von Zellen und Eigelb im Blastula-Stadium in getrennten Schritten schnell unter den richtigen Bedingungen erholen und sich zu kleineren, aber ansonsten normalen Embryonen entwickeln können. Da diese Technik keine spezielle Ausrüstung benötigt, ist sie leicht anpassbar und kann verwendet werden, um eine breite Palette von Skalierungsproblemen zu untersuchen, einschließlich der Robustheit des morphogen vermittelten Musterning.

Introduction

Wissenschaftler wissen seit langem, dass Embryonen eine bemerkenswerte Fähigkeit haben, konstante Körperproportionen zu bilden, obwohl die Embryonengröße sowohl unternatürlichen als auch unter experimentellen Bedingungen 1,2,3stark variieren kann. Trotz jahrzehntelanger theoretischer und experimenteller Studien bleibt diese Robustheit zu Größe Variation, genannt Skalierung, und ihre zugrunde liegenden Mechanismen in vielen Geweben und Organen unbekannt. Um die Dynamik des sich entwickelnden Systems direkt zu erfassen, haben wir eine reproduzierbare und einfache Größenreduktionstechnik in Zebrafischen 4 entwickelt, die den großen Vorteil in vivo live Bildgebunghat.

Zebrafisch hat als Mustertier für Wirbeltiere gedient, um verschiedene Disziplinen der Biologie zu untersuchen, darunter auch die Entwicklungsbiologie. Vor allem ist Zebrafisch ideal für in vivo leben Bildgebung 6, weil 1) Entwicklungkann normal außerhalb der Mutter und der Eierschale, und 2) die Embryonen sind transparent. Darüber hinaus können die Embryonen einigen Temperatur-und Umgebungsschwankungen standhalten, so dass sie unter Laborbedingungen untersucht werden können. Neben der konventionellen Genexpression Störung durch Morpholino und mRNA-Injektion 7,8 haben diejüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9-Technologiedie umgekehrte Genetik im Zebrafisch hocheffizientgemacht. Darüber hinaus können viele klassische Techniken in der Embryologie, wie Zelltransplantation oder Gewebechirurgie,4, 10, 11angewendetwerden.

Die Größenreduktionstechniken wurden ursprünglich bei Amphibien-und anderen nicht-wirbelhaltigen Tieren 12 entwickelt. In Xenopus laevis, einem weiteren beliebten Wirbeltiermodell, kann zum Beispiel die Bisektion entlang der tierisch-vegetalen Achse im Blastula-Stadium mit größenreduzierten Embryonen 12,13 erzeugen. In unseren Händen führt dieser einstufige Ansatz jedoch zu dorsalisierten oder ventralisierten Embryonen in Zebrafischen, vermutlich weil dorsale Determinanten ungleichmäßig verteilt sind und man ihre Lokalisierung aus der Morphologie der Embryonen nicht kennen kann. Hier zeigen wir eine alternative zweistufige Hacktechnik für Zebrafische, die normalerweise sich entwickelnde, aber kleinere Embryonen produziert. Mit dieser Technik werden Zellen zunächst aus dem Tierpol entfernt, einer Region naiver Zellen, die an Organisatorenaktivität fehlen. Um die Menge an Eigelb und Zellen auszugleichen, die für die Epibolie und die anschließende Morphogenese wichtig ist, wird dann Eigelb entfernt. Hier werden wir dieses Protokoll detailliert darstellen und zwei Beispiele für die Größenunauswellen in der Musterbildung liefern; Somitbildung und ventrale Neuralröhren-Muster. In Kombination mit der quantitativen Bildgebung haben wir die Größen-Reduktionstechnik genutzt, um zu untersuchen, wie die Größe von Somiten und Neuralrohr in der Größe reduzierte Embryonen beeinflusst.

Protocol

Alle fischbezogenen Verfahren wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Harvard Medical School durchgeführt. 1. Werkzeug-und Reagenzubereitung Machen Sie eine Drahtschleife, um Embryonen zu hacken Nehmen Sie 20 cm Edelstahldraht, der steif und nicht korrosiv ist, mit einem Durchmesser von 40 μm. Schlaufe den Draht in Glaskapillaren (1,0 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Innendurchmesser, kein Filament),…

Representative Results

Yolk-Volumenreduktion ist wichtig für normale MorphologieWie kürzlich in Almuedo-Castillo et al.17beschrieben, kann die Größenreduzierung von Embryonen erreicht werden, ohne dass das Yolk-Volumen reduziert wird. Zum Vergleich mit und ohne Yolk-Brästeinreduzierung haben wir sowohl zweistufiges Hacken (sowohl Blastula als auch Eigelb) und Blastula-only-Hackerlackieren (Abbildung 2 und SupplementalMovie 1) durchgeführt. Zweistu…

Discussion

In der Vergangenheit wurde bei Wirbeltieren die Größenreduzierung hauptsächlich mit Amphibien-Embryonen durchgeführt, indem die Embryonen in einem Blastula-Stadium 12 entlang der tierisch-vegetalen Achse gekleben. Es gibt jedoch vor allem zwei Unterschiede zwischen Frosch-und Zebrafisch-Embryonen, wenn wir Embryonen beißen. Zunächst befindet sich der Veranstalter in der Phase, in der Zebrafisch-Embryonen tolerant gegen Biskutionspüler werden (Blastula-Bühne), i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützt wurde die Arbeit durch das PRESTO-Programm der Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) und ein National Institutes of Health Granutes (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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