Summary

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

هنا ، نقوم بوصف طريقه للحد من حجم الاجنه الزبرده دون تعطيل العمليات التنموية الطبيعية. تمكن هذه التقنية من دراسة قياس النمط ومتانة النمو ضد تغيير الحجم.

Abstract

في العملية التنموية ، تظهر الاجنه قدره رائعه علي مطابقه نمط أجسامهم مع حجم أجسامهم. يتم الحفاظ علي نسبه الجسم حتى في الاجنه التي هي أكبر أو أصغر ، في حدود معينه. وعلي الرغم من ان ظاهره التحجيم هذه قد اجتذبت الاهتمام لأكثر من قرن ، فان فهم أليات الاساسيه كان محدودا ، ويعزي ذلك جزئيا إلى عدم وجود وصف كمي لديناميات النمو في الاجنه ذات الاحجام المختلفة. للتغلب علي هذا القيد ، قمنا بتطوير تقنيه جديده للحد جراحيا من حجم الاجنه الزكية ، والتي لها مزايا كبيره للتصوير الحي في الجسم. ونحن نثبت انه بعد الازاله المتوازنة للخلايا والصفار في مرحله الخلايا البدائية في خطوات منفصلة ، يمكن للجنين ان يتعافى بسرعة في ظل الظروف المناسبة ويتطور إلى أجنه أصغر حجما ولكنها طبيعيه. وبما ان هذه التقنية لا تتطلب معدات خاصه ، فانها قابله للتكيف بسهوله ، ويمكن استخدامها لدراسة مجموعه واسعه من مشاكل التحجيم ، بما في ذلك متانة الزخرفة بوساطة مورفجين.

Introduction

وقد عرف العلماء منذ فتره طويلة ان الاجنه لديها قدره ملحوظة علي تشكيل نسب الجسم ثابته علي الرغم من ان حجم الجنين يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا في ظل الظروف الطبيعية والتجريبية1,2,3. وعلي الرغم من عقود من الدراسات النظرية والتجريبية ، فان هذا المتانة لتغيير الحجم ، الذي يطلق عليه التحجيم ، وألياته الاساسيه لا تزال غير معروفه في العديد من الانسجه والأعضاء. من أجل التقاط مباشره ديناميات النظام النامية ، انشانا تقنيه الحد من حجم استنساخه وبسيطه في الزرد4، والتي لديها ميزه كبيره في الحية في التصوير5.

وقد عملت zebrafish كنموذج فقاري الحيوانية لدراسة تخصصات متعددة من علم الاحياء ، بما في ذلك البيولوجيا التنموية. علي وجه الخصوص ، الزرد مثاليه لفي الجسم الحية التصوير6 لان 1) يمكن المضي قدما في التنمية عاده خارج الام وقذيفة البيض ، و 2) الاجنه شفافة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تحمل الاجنه بعض درجات الحرارة والتقلبات البيئية ، والتي تسمح لهم بالدراسة في الظروف المختبرية. أيضا ، بالاضافه إلى التقليدية الجينات التعبير عن الاضطراب من قبل مورفينو والحقن mrna7،8، التطورات الاخيره في تقنيه crispr/كاس 9 جعلت الوراثة العكسية في الزرد كفاءه عاليه9. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الكلاسيكية في علم الاجنه ، مثل زرع الخلايا أو جراحه الانسجه4،10،11.

تم تطوير تقنيات الحد من حجم في الأصل في البرمائيات وغيرها من الكائنات غير فقاري12. علي سبيل المثال ، في xenopus لفيس، نموذج آخر فقاري الحيوانية الشعبية ، والميل علي طول محور الحيوانية النباتية في مرحله البدائية يمكن ان تنتج حجم الاجنه المخفضة12،13. ومع ذلك ، في ايدينا يؤدي هذا النهج خطوه واحده في الاجنه البطنية أو البطينية في zebrafish ، من المفترض لان المحددات الظهرية موزعه بشكل غير متساو ولا يمكن للمرء ان يعرف توطينها من المورفولوجية من الاجنه. هنا نظهر تقنيه تقطيع بديله من خطوتين للزبرافين التي تنتج عاده الاجنه النامية ولكن أصغر. مع هذه التقنية ، يتم أزاله الخلايا أولا من قطب الحيوانية ، وهي منطقه من الخلايا الساذجة التي تفتقر إلى نشاط المنظم. لتحقيق التوازن بين كميه صفار البيض والخلايا ، وهو أمر مهم ل epiboly واللاحقة النشاه ، ثم يتم أزاله صفار البيض. هنا ، ونحن بالتفصيل هذا البروتوكول وتقديم مثالين من الثوابت حجم في تشكيل نمط ؛ الجسيده تشكيل والبطنية أنبوب العصبية زخرفه. الاضافه إلى التصوير الكمي ، استخدمنا تقنيه تخفيض الحجم لدراسة كيفيه تاثر احجام الأنابيب العصبية والعصبية في حجم الاجنه المخفضة.

Protocol

وقد نفذت جميع الإجراءات المتعلقة بالأسماك بموافقه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية في كليه الطب بجامعه هارفارد. 1. أداه والتحضير الكاشف جعل حلقه الأسلاك لتقطيع الاجنه خذ 20 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدا التي هي قاسيه وغير قابله للتا?…

Representative Results

انخفاض حجم صفار البيض مهم لمورفولوجية الطبيعيةكما هو موضح مؤخرا في المويدو-كاستيلو وآخرون17، يمكن الحد من حجم الاجنه دون الحد من حجم صفار البيض. للمقارنة مع وبدون خفض حجم صفار البيض ، قمنا بكل من التقطيع علي خطوتين (كل من البدائية والصفار) والتقطيع البدائي فقط (<strong c…

Discussion

تاريخيا ، من بين الفقاري الحيوانية ، تم اجراء تخفيض الحجم بشكل رئيسي باستخدام الاجنه البرمائية ، عن طريق إخراج الاجنه علي طول المحور النباتي للحيوانات في المرحلة البدائية12. ومع ذلك ، هناك أساسا اثنين من الاختلافات بين الاجنه الضفدع والزبرافيش عندما كنا شطر ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل برنامج الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JPMJPR11AA) والمعهد الوطني للمنح الصحية (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Play Video

Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

View Video