تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس
Summary
وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله للكشف عن جميع الفيروسات المعروفة علي وجه التحديد. وأظهرت المصادقة باستخدام عينات الدماغ من داء المخ للأنواع الحيوانية المختلفة ان هذه الطريقة لها حساسية وخصوصية مكافئه لاختبار الأجسام المضادة الفلورية القياسية الذهبية ويمكن استخدامها للتشخيص الروتيني لداء البشر.
Abstract
للكشف عن فيروس داء البشر والأنواع الأخرى من الأعضاء من جنس lyssavirus داخل الاسره Rhabdoviridae, وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله (المتداخلة RT-PCR) للكشف عن المنطقة المحفوظة من الجينات النونوبروتين (N) من الليسيفيروسات. ويطبق الأسلوب النسخ العكسي (RT) باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي كقالب و اليغو (dT)15 و hexamers عشوائية كما الإشعال لتوليف الفيروسية المتكاملة DNA (cdna). ثم ، يتم استخدام cDNA الفيروسية كقالب لتضخيم 845 bp N الجينات جزء في PCR الجولة الاولي باستخدام الإشعال الخارجي ، تليها الجولة الثانية PCR المتداخلة لتضخيم النهائية 371 bp جزء باستخدام الإشعال الداخلية. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن الشقوق الوراثية المختلفة من فيروسات داء القد (RABV). وأظهرت المصادقة ، باستخدام عينات الدماغ 9,624 من ثمانيه أنواع الحيوانية المحلية في 10 سنوات من تشخيص داء البشر السريرية والمراقبة في الصين ، ان الطريقة لديها 100 ٪ حساسية و 99.97 ٪ خصوصية بالمقارنة مع الفلورسنت المباشر اختبار الأجسام المضادة (FAT) ، وهي الطريقة القياسية الذهبية التي أوصت بها منظمه الصحة العالمية والمنظمة العالمية لصحة الماشية. الاضافه إلى ذلك ، فان الطريقة يمكن أيضا تضخيم علي وجه التحديد جزء الجينات N المستهدفة من 15 الأخرى المعتمدة واثنين من الأنواع lyssavirus الرواية في التقرير العاشر للجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV) كما تم تقييمها من قبل الكشف عن تقليد توليف N مورثه البلازميدات من كل [ليسسفيروس]. يوفر الأسلوب بديلا مناسبا للدهون لتشخيص داء السرطان وقد تمت الموافقة عليه كمعيار وطني (GB/T36789) من الصين.
Introduction
داء الإنفلونزا هو مرض حيواني في جميع انحاء العالم تسببه الفيروسات داخل جنس Lyssavirus1. Lyssavirusesات (الاسره Rhabdoviridae) هي واحده سالبه-التي تقطعت بهم السبل الفيروسات RNA مع ما يقرب من 12 كيلو بايت الجينوم ان ترميز خمسه بروتينات: N, فوسفوبروتين (P), مصفوفة البروتين (M), بروتين سكري (G), والبروتين الكبير أو البوليميريز (L). استنادا إلى متواليات النيوكليوتيد من جين N ، والمسافة الجينية ، وأنماط انتيغينيك ، وقد تم تقسيم الفيروسات إلى 16 نوعا ، والتي تتالف من فيروس الداء الكلاسيكي (RABV) والفيروسات المرتبطة بداء البشر (RRV): فيروس الخفافيش لاغوس (LBV) ، وفيروس Duvenhage ), [موتولا] حمي ([موكف]), اوروبيه خفاش [ليسسفيروس] 1 ([ايبلف-1]), الاوروبيه الخفافيش lyssavirus 2 (EBLV-2), الاستراليه الخفافيش lyssavirus (ABLV), الفيروس Aravan (ARAVAN), فيروس Ikoma (IKOV), Bokeloh بات lyssavirus (BBLV), Gannoruwa بات lyssavirus (GBLV), Irkut الفيروسات (IRKUT), [خوجند] حمي ([خوف]), غربيه قوقازية خفاش حمي ([وكبف]), [شيموني] خفاش حمي ([شبف]), و [ليدا] خفاش [ليسسفيروس] ([ليبف])2. وفي الاونه الاخيره ، تم التعرف علي فيروسين إضافيين هما: كوتالاهتي بات ليسسوفيروس (KBLV) معزولة عن مضرب براندت (MyotisBrandistti) في فنلندا في 20173 وتايوان الخفافيش LYSSAVIRUSES (twblv) معزولة عن بييستوريل اليابانية ( Pipistrellus ابراكوس) في تايوان ، الصين في 2016-20174.
جميع الثدييات عرضه لداء المرض. ومع ذلك ، لا آلافات المرضية الاجماليه أو العلامات السريرية المحددة تسمح بتحديدها ، ويمكن اجراء التشخيص فقط في المختبر5. الأسلوب الأكثر استخداما لتشخيص داء السرطان هو الدهون ، والتي تعتبر معيار الذهب من قبل كل من منظمه الصحة الرسمية و5،6. ومع ذلك ، يمكن ان تنتج FAT نتائج غير موثوق بها علي عينات الانسجه الدماغية المتدهورة/الاوتوزيد. بالاضافه إلى ذلك ، فانه لا يمكن استخدامها لفحص عينات السوائل البيولوجية مثل السائل الدماغي الشوكي ، واللعاب ، والبول ، التالي إلى حد كبير الحيلولة دون توظيفها في التشخيص قبل وفات7. الاختبارات التشخيصية التقليدية البديلة ، مثل اختبار العدوى الثقافة الانسجه داء الجلد (رتجيت) واختبار التلقيح الماوس (MIT) ، تتطلب عده أيام6، وهو العيب الرئيسي عندما التشخيص السريع أمر ضروري.
الاختبارات التشخيصية الجزيئية المختلفة (علي سبيل المثال ، الكشف عن الحمض الريبي الفيروسي عن طريق RT-PCR ، الفحص المناعي المرتبط بالانزيم PCR [PCR-ELISA] ، في التهجين الموضعي ، وفي الوقت الحقيقي PCR) تستخدم كتقنيات سريعة وحساسة لتشخيص داء السرطان8. ويوصي الآن RT-PCR من قبل المعهد البيطري لتشخيص داء السرطان الروتيني ، ويوصف PCR (hn) في دليل الاختبارات التشخيصية واللقاحات للحيوانات البرية للكشف عن جميع الفيروسات المضادة للفيروسات5. هنا نحن وصف لعموم lyssavirus المتداخلة RT-PCR ، الذي يسمح الكشف المحددة والحساسة لجميع أنواع الفيروسات الثمانية عشره مقارنه أو تتجاوز التي حصلت عليها FAT. المبدا من الأسلوب [رت] من الهدف [رنا] (يحفظ منطقه من ال [ليسسفيروس] ن مورثه) داخل [كدنا], يتبع بالتضخيم من ال [كدنا] باثنان جولات [بكر]. يخضع cDNA الجولة الاولي PCR مع الإشعال الخارجي لتضخيم جزء bp 845; ثم ، يستخدم PCR الجولة الثانية المنتج PCR الجولة الاولي كقالب لتضخيم جزء bp 371 مع الإشعال الداخلية. الطلقتين من PCR زيادة كبيره في حساسية الفحص.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي الوقت الراهن ، فان الشركة هي أحد الفيروسات الرئيسية المسؤولة عن تقريبا كل داء البشر والحيوانية في الصين ، وكذلك في بلدان أخرى. الاضافه إلى ذلك ، تم التعرف أولا علي متغير من نوع irkv من الخفافيش التي كانت من نوع “اورنا ليوكواستر ” في مقاطعه جيلين في شمال شرق الصين في ال2012…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت الدراسة الخطة الوطنية الرئيسية للبحث والتطوير (المنحة رقم 2016YFD0500401) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
