Допрос зародышевых центров отдельных аутореактивная по Photoactivation в модели смешанного химерных аутоиммунитета

Использование всех животных соответствовал руководящим принципам Европейского сообщества и был одобрен в датской инспекции исследования животных (2017-15-0201-01348). 1. Общие мыши животноводства и подготовка буферов и инструменты Дом мыши линии условиях конкретного возбудителя бесплатно (SPF), с периодический контроль состояния здоровья согласно стандартных руководящих принципов. Дополнительно: Проверьте отсутствие спонтанных зародышевых центров наивно мышей из-за не мониторинг случайного инфекции. Это может быть сделано либо путем иммунофлуоресценции (наличие структур зародышевого центра) или проточная цитометрия (частота зародышевого центра B клеток) как описано12.Примечание: Либо женщины или мужчины могут быть использованы. Как правило он идеально подходит для секса матча доноров и получателей, как несоответствие секса теоретически может привести к alloreactivity к мужской Y-антигена,15женщин-получателей/доноров. Использование CD45.1 получателей (B6. SJL -Ptprc ЭППУb/BoyJ) в возрасте около 6-10 недель. Используйте 564Igi (B6. Cg-Ightm1 тик (Igh564)Igktm1 тик (Igk564)/j) и ПА-GFP (B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) доноров в возрасте 6-12 недель. Стерилизовать хирургические инструменты (прямо тонкой ножницы и щипцы Дюмон #5 и #7) путем автоклавирования их согласно обычной стерилизации руководящие принципы. Подготовка 500 мл костного мозга (БМ) буфер, содержащий фосфат амортизированное saline (PBS), 2% плода Bovine сыворотки (ФБС), 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) при рН 7,4. Подготовить BM буфера, добавить 10 мл инактивированная тепла (1 час в водяной бане 56 ° C для инактивации дополнение) FBS и 1,25 мл раствора 400 мм ЭДТА (скорректирована с рН 7,4) до 500 мл и PBS, рН 7,4, смесь хорошо. Фильтр буфер с помощью колбу фильтра 0,2 мкм. Подготовка 10 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (155 мм NH4Cl, 12 мм NaHCO3, ЭДТА 0,1 мм) путем разбавления 1 мл акций 10 x 10 мл общего объема реагента класс водой. Подготовка 50 мл PBS с 5 мм ЭДТА, рН 7,4. 2. создание смешанной костного химер Облучение получателей (день 0) CD45.1 костный мозг получателей в контейнере соответствующего облучения и облучать с 1100 Rad в гамма облучателя.Примечание: Может использоваться альтернативная облучения источниками. Независимо от источника дозы и сроки должен быть оптимизированы, чтобы принести максимальный myeloablative эффект с повреждения минимальный залог тканей животных. Место на антибиотик воды ad libitum (1 мг sulfadiazin и 0,2 мг, триметоприм/мл питьевой воды). Извлечение из костей (1 день) Анестезировать доноров костного мозга 564Igi, непрерывный поток 4% изофлюрановая в воздухе и усыпить шейки матки дислокации. Спрей вниз доноров с этанолом и разместить их на стерильные хирургические колодки в капот потока. Приступить к работе, поддержании стерильных условиях, с использованием стерильных буферов и оборудования. Чтобы извлечь бедра и голени, сначала надрезают вокруг лодыжки и продлить вверх весь путь до бедра, прямо тонкой ножницами. С помощью тяжелого щипцами или палец и указательный пальцы, потяните кожу вверх и от ноги к телу. Аналогичным образом, потяните кожу вниз и с ног. Выскочить коленного и голеностопного суставов, схватил ногу на бедра и потянув ногу насильственно. Перейти к разорвать лодыжки совместных и вытащить ноги к телу удерживая голени, тем самым лишая сухожилий и мышц от голени. Разорвать колена совместного выпустить голени и аналогичным образом тянуть это к телу удерживая бедренной кости, тем самым лишая сухожилий и мышц от бедра. Сделать надрез на тазобедренном суставе и вырезать сухожилия, а затем вытащить бедренной кости от хип сокета. Повторите шаги 2.2.2-2.2.4 на контралатеральную сторону. Тщательно очистите кости, потерев их с грубой бумажное полотенце, чтобы удалить все оставшиеся мышц и соединительной ткани. Затем промойте их в ледяной BM буфера перед наконец их свежей холодной BM буфер на льду, с помощью пары Дюмон #7 щипцов. Повторите шаг 2.2 для PA-GFP доноров.Примечание: Количество клеток костного мозга от одного донора варьируется в зависимости от пола и возраста. Масштаб числа доноров согласно коэффициенты желаемой ввода костного и числа и нужное количество получателей. Если доноры не хватает, Передние конечности могут быть включены для извлечения костного мозга. Это обычно дает дополнительную 1/3 до ½ клеток, полученных из задних конечностей. Как правило везде от 50-200 миллионов клеток могут быть восстановлены на доноров, в зависимости от возраста, пола, происхождения и ли включены только задние или задние и передние конечности. Извлечение клеток костного мозга Подготовьте раствор, промыв в ледяной BM буфера. Слейте буфер полоскания и использовать контроллер электрической пипетку с 10 мл Серологические Пипетки для добавления 10 мл свежего ледяной BM буфера. Передать минометов, используя пару Дюмон #7 щипцами кости из 564Igi доноров и пользуйтесь толкателем раздавить и измельчения костей выпустить костного мозга. Аспирационная экстракт костного мозга с 10 мл Серологические Пипетки и передать его через сито ячейки 70 мкм в 50 мл трубки на льду. Добавьте еще 10 мл свежего ледяной BM буфера с раствором и повторите для обеспечения полного восстановления клеток. Удаление костный материал из минометов с бумажным полотенцем, отменить надлежащим образом и смыть раствор тщательно с 70% этиловом спирте, после чего буфера BM. Повторите шаг 2.3 для PA-GFP группы доноров костного мозга. Подсчет клеток костного мозга Использование микропипеткой, место капли, содержащие 40 мкл буфера lysis РБК на кусок пластика парафин фильма. Инвертировать трубки костного 564Igi несколько раз и вывезти 10 мкл аликвота, используя микропипеткой. Смешайте его с 40 мкл капли буфера lysis РБК. Впоследствии 50 мкл Трипановый синий (0,4% в водном растворе) до капли. Сразу же загрузите 10 мкл результате смесь в Burker-Тюрк Горяева и count под микроскопом. Рассчитайте количество клеток / мл, используя 10 x коэффициент полного разрежения. Подтвердить жизнеспособность клеток адекватных > 90%. Повторите шаг 2.4 для PA-GFP группы доноров костного мозга. Подготовка доноров суспензий На основе графов, полученные на шаге 2.4 и нужное количество получателей, рассчитайте объем доноров костного мозга от каждого из двух донорских групп быть смешаны в трубе смеси доноров.Примечание: например, для создания одной группы смешанного 564Igi:PA 1:2-GFP химер с 6 CD45.1 получателей: каждый получатель требует 20 х 106 доноров клеток всего, 1 часть 564Igi и 2 части ПА-GFP. Таким образом, это требует 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 клеток донора 564Igi и 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 ПА-GFP доноров клеток. Смешайте необходимое количество PA-GFP и 564lgi костного мозга донора в 50 мл Конические трубки. Центрифуга костного смеси на 200 x g и 4 ° C на 10 минут, с помощью поворотной ведро ротора. Декант супернатант и Ресуспензируйте клетки в ледяной BM буфера на плотность составляет 1 x 108 клеток / мл. Переезд в пробки microcentrifuge помощи 1,5 мл на льду. Воссоздание костного получателей с доноров костного мозга Анестезировать получателей с помощью индукции с непрерывным потоком 4% изофлюрановая в воздухе, следуют обслуживания на 3,75%. Проверка надлежащего плоскости анестезии, отсутствие мыс щепотка рефлекс. Осторожно проведите трубка, содержащая костного микс для обеспечения адекватного ресуспендирования клеток костного мозга, а затем 200 мкл аспирата костного смеси (~ 20 x 106 клеток), в 0,3 мл, 30 калибровочных инсулина шприца. Место получателя на своей стороне, мягко растянуть кожу выше и ниже глаз немного поп глаз вне и осторожно вставьте кончик шприца примерно под углом 30° в передней части глазницы, заботясь, чтобы избежать глаз и окружающих тканей. Когда кончик иглы ощущается на ощупь кости, подчеркивая глазницы, убрать немного (~0.5 мм) и медленно залить доноров костного мозга с помощью постоянное давление.Примечание: Там должно быть без кровотечения, отсутствие утечки жидкости и не очень мелкие выпуклые глаза после инъекции. Возвращение мыши в клетке с ad libitum антибиотик водой и проверить немедленного восстановления от процедуры. Повторите шаг 2.6 для каждого получателя.Примечание: Хвост-Вену может быть использован вместо retroorbital инъекции с аналогичными результатами, однако, в наших руках это значительно медленнее, что может быть проблемой при работе с большими группами получателей. Восстановления анестезированные животных непосредственно на подстилке малого диаметра следует избегать, поскольку это создает риск аспирации и удушение Удаление антибиотик воды (день 14) Удаление антибиотик воды из cage(s) и замените регулярные питьевой водой. 3. Проверка успешного растворения и проверка надлежащей степени химеризма (неделя 6) Retroorbital кровотечение химер и элементов управления Подготовка трубки для сбора крови, маркировки 1,5 мл microcentrifuge трубы согласно tag номера получателя уха и добавляя 50 мкл PBS, содержащих 5 мм ЭДТА.Примечание: Включать соответствующие элементы управления для PA-GFP, CD45.1 и CD45.2 и 9D 11 (идиотип). Это может быть сделано путем включения 1 ПА-GFP + мышь, 1 CD45.1 мыши, 1 В6 мыши и 1 564Igi мышь. Анестезировать мышей и проверки надлежащего плоскости анестезии как шаг 2.6.1. Химера на его стороне, мягко растянуть кожу выше и ниже глаз немного поп глаз вне. Аккуратно вставьте Майлар завернутый гепаринизированным капиллярной трубки (60 мкл внутренний объем) примерно на 40° угол в передней части глазницы, заботясь, чтобы избежать повреждения глаз и окружающих тканей. Аккуратно твист/поверните трубку до тех пор, пока он начинает заполнять с кровью. Позволит кровь пассивно заполнения трубки, капиллярность, пока почти полностью, затем убрать трубки и поместить его в соответствующий трубу предварительно помечены коллекции, в то время как в то же время, сразу же расслабляющий сцепление вокруг глаз, чтобы позволить глаза урегулировать обратно в позицию. Следует немедленно прекратить кровотечение. Убедитесь, что капилляр опорожняется в коллекции трубку и выбросьте его в Шарпс контейнер. Закройте трубку и инвертировать три раза, чтобы обеспечить полное смешивание с ЭДТА PBS. Вернуть указатель мыши к клетке и проверить немедленного восстановления от процедуры. Повторите шаг 3.1 для каждой экспериментальной мыши и соответствующие элементы управления.Примечание: Соблюдайте осторожность при использовании пункция подчелюстной ключе, как этот метод может представляют больший риск случайного инфицирования в облученных получателей, прежде чем они полностью восстановлена. Кроме того в нашем опыте, мы находим, что объем крови и количество крови, потерянных из-за чрезмерного кровотечения больше переменной. Оба эти соображения важны, как костного химер чувствительны в фазе растворения, прежде чем новый костного мозга является полностью прижившимися и кроветворения возобновил нормальные уровни. Периферической крови одноядерных клеток (КСДОР) очистка После завершения сбора крови, кратко (10 s) центрифуга трубы на низкой скорости (< 200 x g) для сбора разреженного стабилизировалась крови в нижней части трубы. Заполните шприц 10 мл с лимфоцитов разделение среднего и прикрепить иглы 18 G. Вставьте иглу в нижней части первой трубки и стяжки образца крови с 1 мл лимфоцитов разделения среды. Осторожно снять иглу и протереть бумажным полотенцем для предотвращения перекрестного загрязнения следующего образца. Пройдите все образцы, а затем центрифуги за 25 минут на 800 x g, при комнатной температуре, в центрифугу размахивая ведро с тормозами, равным низкий/выкл. Подготовьте набор соответственно помечены 1,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 1 мл ледяной BM буфера. После центрифугирования, для каждого образца введите верхний (плазмы) слоя с 200 мкл микропипеткой и аспирационная мононуклеарных клеток (MNC) слой чуть выше интерфейс. Передать клетки соответственно помечены трубка, содержащая 1 мл BM буфера. Закройте крышку и перевернуть смешивать. Выбросите лимфоцитов разделения средне содержащих трубки. Пройдите все образцы и затем центрифуги на 200 x g за 5 мин., 4 ° C в размахивая ведро ротора. Аспирационная и удалить супернатант Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл ледяной BM буфера. Образцы уже готовы для пятнать антитела и анализа гранулярных потока. Пятнать для оценки потока гранулярныхПримечание: Предложил панель: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A568, CD45.2-APC. Non активированный ПА-GFP обнаруживается в Тихоокеанском канале оранжевый (или эквивалент). Не краска жизнеспособности требуется, как разделение лимфоцитов избавляется от мертвых клеток. С помощью микропипеткой, добавьте 100 мкл суспензии клеток за хорошо для каждого образца, химеры и управления, 96-луночных пластины. Для 3 номера PA-GFP контрольных образцов бассейн оставшиеся 100 мкл каждого образца (всего 300 мкл). Добавьте 50 мкл этого материала для неокрашенных управления и окрашенных контроля скважин. Для управления сингл окрашенных ПА-GFP дополнительно 50 мкл неокрашенных ПА-GFP образца. Для каждой скважины 100 мкл буфера (неокрашенном), одного антитела (сингл окрашенных компенсации элементы, за исключением PA-GFP компенсации управления) или смесь антител (образцы). Инкубируйте на льду за 20 минут. Центрифуга на 200 x g 5 минут при 4 ° C. Флик из буфера. Добавить 200 мкл буфера BM в каждой скважине и снова центрифуги для стирки. Флик из буфера и Ресуспензируйте клеток в каждой скважине в 200 мкл буфера BM. Образцы уже готовы для анализа на проточный цитометр (рис. 1).Примечание: Зародышевого центра ответы в химеры могут быть проанализированы в любой точке 6 недель и более. 4. В естественных условиях маркировки маргинальные зоны/Субкапсулярной синуса для идентификации одного зародышевых центров по оказанию помощи Примечание: Настоящий протокол продемонстрировал зверолов/Хок (подколенной лимфоузлов) и инъекции внутривенные (и.в., селезенки), но может быть изменено в соответствии с целевой сайт. Двусторонние зверолов инъекции для маркировки подколенной лимфатических узлов Анестезировать мышей как шаг 2.6.1. В трубу microcentrifuge 1,5 мл развести 2 мкл антител CD169 анти мыши PE-меченых крыса в 18 мкл PBS, рН 7,4. Место два капель 10 мкл смеси на кусок пленки пластиковые парафина. Аспирационная каждая капелька с помощью 0,3 мл инсулина шприца с иглой 30 колеи. Придать 10 мкл маркировки смеси в любом зверолов (Введите иглу под углом 5-10° в центральной части зверолов, проксимальной с самого начала пальцами и вставить иглу примерно на полпути к пятке) или Хок (Введите иглу на 5 – 10 ° угол чуть выше пятки и вставить о середине его длины вдоль оси ахиллова сухожилия в направлении колена). Вернуть их клетки мышей и подождать около 15 минут, прежде чем продолжить с шага 5. Внутривенные инъекции для маркировки селезенки Анестезировать мышей как точка 2.6.1. В трубу microcentrifuge 1,5 мл развести 10 мкл антител CD169 анти мыши PE-меченых крыса в 90 мкл PBS. Аспирационная смесь с 0,3 мл шприц инсулина. Выполнение инъекции и.в. retroorbital в соответствии с шагом 2.6. Вернуть их клетки мышей и подождать около 15 минут, прежде чем продолжить с шага 5.Примечание: в качестве альтернативы изофлюрановая, инъекции анестетика, такие как кетамин/Ксилазина смеси могут быть использованы; Однако это обычно приводит к увеличению времени восстановления. Так как лимфатический дренаж обычно влиянием движения скелетных мышц, это должно привести к медленнее время опорожнения. 5. explanting селезенки и лимфатических узлов и подготовка к photoactivation Подготовка двухсторонняя палата изображений и photoactivation Удалите поршень из 20 мл шприц и обратно нагрузки он с вакуумной смазка, вставив насадка Трубки вакуумные масла в него. Затем удалите поршень от шприц 5 мл и используйте 20 мл шприц для обратно нагрузки он вакуумные смазкой. Используйте пылесос смазка загружен 5 мл шприц для подготовки изображений и photoactivation палаты, поместив квадратных coverslip на плоской поверхности и отслеживания по краям coverslip с вакуумной жира (около 1-2 мм от края).Примечание: позаботьтесь, чтобы избежать загрязнения вакуумного смазка всех поверхностей, которые впоследствии соприкасаться с объектива микроскопа, как microdroplets вакуумных смазки эмульгированных в воде погружения может загрязнить объектив. Заполните вверх вакуумные смазка камеры крышка выскальзования с ледяной BM буфера и место на холодную ровную поверхность. Заготовка лимфатических узлах и селезенке Усыпить в естественных условиях помечены химерных мышь, чтобы быть проанализированы в соответствии с шагом 2.2.1. Спрей вниз каркаса с 70% этиловом спирте. Для доступа в подколенной лимфатических узлов, используйте прямо тонкой ножницы, чтобы сделать надрез в коже чуть ниже колена яму и продлить отрезок вверх вдоль линии подколенного сухожилия почти до тазобедренного сустава. С помощью Дюмон #5 и #7 щипцы, тянуть каждый из выставленных закрылки кожи наружу, чтобы разоблачить ткани в подколенной ямки (рисунок 2A). Используя пару Дюмон #5 щипцов, внимательно введите подколенной ямки медиальной просто подколенной Вены и вскрыть открыть жира путем вставки и открытия и закрытия щипцы вдоль оси конечности, чтобы разоблачить базовой подколенной лимфатических узлов. Поп лимфатических узлов из ямки, щипать четырехглавой мышцы от лицевой стороны проксимальнее колена, используя большой палец и указательный палец (рис. 2B). Захватите лимфатических узлов снизу с щипцами для освобождения его от окружающих тканей (рис. 2 c), а затем поместить его в зале вакуумные смазка, подготовленную на этапе 5.1. Повторите шаги 5.2.2 – 5.2.4 на контралатеральную сторону. Несколько лимфатические узлы могут быть установлены в одной камере, при желании. Наконец закройте камеру, поместив вторую coverslip поверх вакуумные смазка обода и давит осторожно, стараясь выдавить все пузырьки воздуха.Примечание: Некоторые из буфера может вытолкнуть также, но вакуумные смазка должна образуют плотное прилегание, предотвращения утечки жидкости (Рисунок 2D). Лимфатические узлы находятся теперь в двухсторонний тепловизионной камере. Для доступа к селезенке, используя пару прямо тонкой ножницы сделать надрез через брюшную стенку на левой стороне мыши, проксимальнее передней медиальной линии чуть ниже грудной клетки и продлить его вокруг тела по задней подмышечной линии. Кончик селезенки должно быть видно (рис. 3A). Вытяните селезенки с парой Дюмон #7 щипцов и вырезать спаек на нижней выпустить его. Использование пара прямо тонкой ножницы сократить ~ 2 мм толщиной, поперечного сечения, ломтики. Место среза в зале вакуумные смазка, подготовленную на этапе 5.1. Несколько фрагментов хандра могут быть установлены в одной камере, при желании. Наконец закройте камеру, поместив вторую coverslip поверх вакуумные смазка обода и давит осторожно, стараясь выдавить все пузырьки воздуха. Все тепловизионные камеры на льду все время сохраняйте, за исключением во время визуализации и photoactivation.Примечание: Некоторые из буфера может вытолкнуть также, но вакуумные смазка должна образуют плотное прилегание, предотвращения утечки жидкости. Ломтики селезенки в настоящее время двухсторонний тепловизионные камеры (рис. 3B). 6. Photoactivation Определение единого зародышевых центровПримечание: Этот Протокол описан для селезенки, но полностью аналогична для лимфатических узлов. Место тепловизионной камеры на микроскопа. С помощью пипетки пластиковые передачи 3,5 мл, поместите каплю дистиллированной воды поверх верхней coverslip и ниже цели до точки соприкосновения. Фокус на вершине ткани, используя пропускаемого света. Переключитесь в темный режим и два Фотон возбуждения и настроить лазер для 940 нм.Примечание: С наборами соответствующий фильтр, эта длина волны позволяет возбуждения и обнаружения второго поколения гармоник в коллагена содержащих структур, связанных с крупных сосудов и структурные элементы, а также CD169-PE вводят в шаге 4.2, который Идентифицирует маргинальные зоны. Однако 940 нм возбуждения вовсе не photoactivate ПА-GFP. Локализовать отдельных областей белый целлюлозы (ограниченная окрашивание CD169-PE) вблизи поверхности ткани и идентифицировать periarteriolar лимфоидной оболочка (PALS, Т-клеток зоны), второе поколение гармоник, связанные с Центральной артериолы. В зоне между Палс и маргинальные зоны, посмотрите на наличие весьма autofluorescent, активированный окрашивающийся тело макрофагов (сильный autofluorescent сигнала на всех каналах, blob-вид с темной вакуолей) (рис. 4A).Примечание: В случае необходимости, из-за нежелательной ориентации ткани, тепловизионные камеры могут быть отражено и изображений могут быть выполнены из другого направления. На основании признаков, указанных в шаге 6.1.3., нарисуйте область интереса, определения области одного зародышевого центра. Настройка Z-стек около 100-150 мкм глубины, начиная с поверхности ткани и с использованием размера шага ~ 3 мкм. Переключиться на волны возбуждения 830 нм. Выключить или затемнить все каналы для предотвращения фотоповреждения детекторы (как мощность лазера и выход флуоресценции обычно значительно выше на этой длине волны) и затем «образ» стек.Примечание: Конкретные параметры, такие как лазерная мощности и пиксель продолжительность, зависит от глубины в ткани, конкретные ткани используется и система электронного фотографирования. Каждое приложение должно быть оптимизирована для конкретной системы обработки изображений используется. Хотя важно, чтобы получить эффективный photoactivation во всем стеке, следует позаботиться не фотоповреждения клетки. Вернуться к волны возбуждения 940 нм и открыть каналы. Сканирование через стек для подтверждения эффективной photoactivation всей (рис. 4B) и отсутствие фотоповреждения (диффузный, не связанной ячейки ПА-GFP сигнал, темные пятна или высокой степенью аутофлюоресценция в photoactivated районе). Перейти к photoactivate всех соответствующих тканей в тепловизионной камере, а затем незамедлительно вернуть его на льду до дальнейшей обработки. Перейти с photoactivation дополнительных тепловизионных камер.Примечание: Ткани explanting, монтажа и особенно photoactivation трудоемких процессов, но общий оборот вокруг времени должно быть ограничено до 4-6 часов, чтобы предотвратить резкое снижение жизнеспособности клеток. 7. восстановление и анализ photoactivated клеток Извлечение лимфоцитов из лимфатических узлов и селезенки Для каждого образца, photoactivated Подготовьте соответствующим образом помечены 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл буфера БМ на льду. Включает образцы из элемента управления не PA-GFP и неактивированные ПА-GFP мыши. Это достигается путем включения одного управления B6 и один мышь управления ПА-GFP. Осторожно удалите верхняя крышка выскальзования из тепловизионной камеры, заботясь, чтобы сохранить позицию образцов (если несколько образцов присутствуют в одной камере) и место каждого образца в своих соответствующих образцов трубку. С помощью пестика гомогенизатор, сжать ткани и твист пестиком в трубе выпустить лимфоцитов. С помощью микропипеткой, аспирационная lysate и процеживают через сито ячейки 70 мкм в пробки microcentrifuge свежий, предварительно охлажденный 1,5 мл. Для образцов лимфатический узел перейдите к шагу 7.1.5. Для образцов селезёнки центрифуги на 200 x g 5 мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл буфера lysis РБК. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, затем 800 мкл ледяной BM буфера и перейти к шагу 7.1.5. Центрифуга на 200 x g 5 мин при 4 ° C в размахивая ведро ротора. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 200 мкл ледяной BM буфера. Образцы уже готовы для окрашивания для оценки потока гранулярных и сортировки, при желании. Пятнать для оценки потока гранулярныхПримечание: Предложил панель: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D 11-A647, CD38-PE-Cy7, поправимо жизнеспособности краска Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Non активированный ПА-GFP обнаруживается в Тихоокеанском канале оранжевый (или эквивалент). Photoactivated ПА-GFP обнаруживается в канале GFP. Окрашивание с CD169-PE и используя это как дамп ворота могут быть исключены любой совместной очищенную макрофагов (которые могут или не могло быть в естественных условиях помечены CD169-PE). С помощью микропипеткой, добавьте 100 мкл суспензии клеток за хорошо для каждого образца, химеры и управления, в 96-луночных пластине. Для B6 контрольных образцов 50 мкл этого материала для неокрашенных управления и окрашенных контроля скважин. Для управления неактивированные сингл окрашенных ПА-GFP дополнительно 50 мкл неокрашенных неактивированные ПА-GFP образца. Для элемента управления активированный ПА-GFP, сингл витражи бассейн оставшийся материал для всех образцов photoactivated. Каждому хорошо, 100 мкл буфера (незапятнанное и контролирует ПА-GFP компенсации), одну антитела (сингл окрашенных компенсации управления) или смесь антител (photoactivated образцов). Инкубируйте на льду за 20 минут. Центрифуга на 200 x g 5 минут при 4 ° C. Флик из буфера. Добавить 200 мкл буфера BM в каждой скважине и снова центрифуги для стирки. Флик из буфера и Ресуспензируйте клеток в каждой скважине в 200 мкл буфера BM. Образцы уже готовы для анализа на проточный цитометр или сортировщик (представитель результаты на рис. 5).