Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في العمليات الخلوية ويتم تنسيقها بإحكام من قبل deubiquitination. العيوب في كل من ردود الفعل تكمن وراء الأمراض البشرية. نحن نقدم بروتوكولات لإجراء رد فعل في كل مكان وdeubiquitination في المختبر باستخدام المكونات النقية.
Ubiquitination هو تعديل ما بعد الترجمة الذي يلعب أدوارا هامة في مسارات الإشارات المختلفة ويشارك بشكل ملحوظ في تنسيق وظيفة الكروماتين والعمليات المرتبطة بالحمض النووي. ينطوي هذا التعديل على عمل متسلسل من العديد من الإنزيمات بما في ذلك E1 يوبيكويتين-تفعيل, E2 يوبيكويتين-الاقتران وE3 في كل مكان-ligase وعكس هابيكويتيناسيس (DUBs). في كل مكان يحفز تدهور البروتينات أو تغيير وظيفة البروتين بما في ذلك تعديل النشاط الأنزيمي، والتفاعل بين البروتين والبروتين والتوطين تحت الخلية. خطوة حاسمة في إظهار البروتين في كل مكان أو deubiquitination هو أداء ردود الفعل في المختبر مع المكونات النقية. يمكن أن تتأثر ردود الفعل الفعالة في كل مكان وdeubiquitination إلى حد كبير من قبل المكونات المختلفة المستخدمة، والعوامل المشتركة الإنزيم، وظروف العازلة، وطبيعة الركيزة. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات خطوة بخطوة لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination. نحن نوضح هذه ردود الفعل باستخدام مكونات الحد الأدنى من الماوس مجمع بوليكومب القمعية 1 (PRC1)، BMI1، وRING1B، وهو E3 ubiquitin ligase أن monoubiquitinates histone H2A على يسين 119. يتم تنفيذ ثنائي ة من H2A النيوكليوسومال باستخدام الحد الأدنى من مجمع Deubiquitinase القمعية بوليكومب (PR-DUB) التي شكلتها ثنائية الإنسان BAP1 ومجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) من العامل المشارك ASXL2. ويمكن إجراء هذه الاختبارات في كل مكان / اللوب في سياق إما النيوكليوسوم المؤتلف المعاد تشكيله مع البروتينات المنقاة للبكتيريا أو النيوكليوسومات الأصلية النقية من خلايا الثدييات. ونحن نسلط الضوء على التعقيدات التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على ردود الفعل هذه، ونقترح أن المبادئ العامة لهذه البروتوكولات يمكن تكييفها بسرعة مع غيرها من E3 في كل مكان ligases وdeubiquitinases.
Ubiquitination هي واحدة من التعديلات الأكثر حفظا بعد الترجمة وحاسمة لمجموعة واسعة من الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والنباتات والفقاريات. يوبيكيتيشن يتكون من مرفق التكافؤ من يوبيكويتين، وهو 76 ببتيد الأحماض الأمينية المحفوظة للغاية، لاستهداف البروتينات ويحدث في ثلاث خطوات متتالية تنطوي على ثلاثة أنزيمات، أي E1-تفعيل، E2-الاقتران وE3 ligase1، 2،3. يلعب هذا التعديل ما بعد الترجمة أدوارًا مركزية في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في الواقع، فإن الأربطة E3، والتي توفر خصوصية رد الفعل، تشكل عائلة عظمى كبيرة من الإنزيمات وهي الإنزيمات الأكثر وفرة من نظام ubiquitin4،5،6. تعتمد الآثار النهائية للبروتين في كل مكان على طبيعة التعديل: أحادية الشبه، ومتعددة أحادية المونوبية، وتعدد الأقطاب الخطي أو المتفرع. نادرا ً ما يرتبط المونوبيكويتين بالتدهور البروتياسومال، ولكن بدلاً من ذلك يشارك هذا التعديل في التوسط في مختلف أحداث الإشارات. [بولوبقويتيتينأيشن] يتضمّن ال [ن-ترمينل] أو اليسين بقايا في [أوبقويقويتين] جزيء نفسه, والمصير من بروتين [بولوبقويتينت] يعتمد على أيّ بقايا يكون تضمّنت في [أوبقويتين] سلسلة إمتداد. ومن المعروف منذ فترة طويلة أن تعدد الحالات المضلع ة بوساطة يسين 48 من يوبيكويتين يسبب تدهور البروتياسومال. على العكس من ذلك، غالباً ما يرتبط تعدد الموبيكتيين عن طريق يسين 63 من أوبكويتين مع تنشيط البروتين7،8،9. على غرار التعديلات الهامة الأخرى بعد الترجمة، في كل مكان هو عكسها ويتم ضمان إزالة ubiquitin من البروتينات من قبل البروتياز محددة تسمى deubiquitinases (DUBs)، والتي ظهرت كجهات تنظيمية هامة للعمليات الخلوية 2 , 10.الأهم من ذلك، العديد من DUBs هي متخصصة للغاية، وتنظيم، من خلال deubiquitination، ركائز محددة، مما يشير إلى أن التوازن الدقيق بين في كل مكان وdeubiquitination أمر بالغ الأهمية لوظيفة البروتين. E3s وDUBs، جنبا إلى جنب مع آلات التحلل بروتياسوم والعوامل التبعي، تشكل نظام البروتياسوم Ubiquitin (UPS، مع > 1200 الجينات) الذي ينظم مسارات الإشارات الرئيسية، والتي يرتبط العديد منها مع نمو الخلايا وانتشارها، تحديد مصير الخلية، والتمايز، وهجرة الخلايا، وموت الخلية. الأهم من ذلك، إلغاء الضوابط التنظيمية من العديد من السلاسل التعاقبية الإشارات التي تنطوي على في كل مكان يعزز تكوين الأورام وأمراض التنضد العصبي5،11،12،13، 14.
يلعب التمركز أدوارًا متفشية في بيولوجيا الكروماتين والعمليات المعتمدة على الحمض النووي15و16و17. على سبيل المثال، المونوبيكيت من الهيستون H2A على يسين 119 (فيما يلي H2A K119ub) هو تعديل ما بعد الترجمة الحرجة المشاركة في القمع النسخي وإصلاح الحمض النووي18،19،20، 21،22. يتم تحفيز H2A K119ub من قبل مجمع بوليكومب القمعي 1 (PRC1)، الذي يلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على المعلومات الوراثية ويتم الحفاظ عليها بشكل كبير من دروسوفيلا إلى الإنسان. يتكون PRC1 الكنسيبشكل خاص من قبل RING1B و BMI1، والتي هي الأساسية E3 مجمع ubiquitin ligase المسؤولة عن الحدث في كل مكان المذكورة أعلاه22،23. في دروسوفيلا، يتم عكس H2A monoubiquitination (H2A K118ub الذي يتوافق مع H2A K119ub في الثدييات) من قبل كاليبسو دوب ، الذي يتفاعل مع مشط الجنس إضافية (ASX) تشكيل مجمع دوب بوليكومب القمعية (PR-DUB)24. وتقويم الثدييات من كاليبسو، BAP1، هو مثبط الورم حذف أو تعطيل في الأورام الخبيثة البشرية المختلفة25،26،27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33.BAP1 ينظم العمليات التي تعتمد على الحمض النووي في النواة والكالسيوم إشارة بوساطة المبرمج في الشبكية endoplasmic33،34،35،36، 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.BAP1 يجمع مجمعات البروتين متعددة الوحدات الفرعية التي تحتوي على المنظمين النسخ لا سيما ASXL1، ASXL2 وASXL3 (ASXLs)، ثلاثة orthologues من ASX38،43. ASXLs استخدام مجال DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD)، وتسمى أيضا مجال ASXM، لتحفيز نشاط BAP1 DUB35،36،44. وبالتالي، ASXLs تلعب أدوارا هامة في تنسيق نشاط BAP1 DUB في الكروماتين وعلى نطاق أوسع وظيفتها قمع الورم.
توجد عدة طرق لدراسة عمليات التمركز والتجريد من الأويوبية. وتجدر الإشارة إلى أن الاختبارات البيوكيميائية التي تستخدم البروتينات المنقّهة من البكتيريا لا تزال قوية جداً في إظهار الانتشار المباشر لركائز محددة أو إزالة كل شيء منها. ويمكن إجراء هذه التجارب للتحقيق في مجموعة من المعلمات مثل تحديد متطلبات الحد الأدنى من المجمعات، وتحديد ردود الفعل الحركية، وتحديد العلاقات بين الهيكل/ وظيفة، وفهم تأثير المرضية الطفرات الجينية. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات لإجراء ردود الفعل في كل مكان وdeubiquitination على ركائز الكروماتين مع مكونات تنقية. كنظام نموذجي، يتم تقديم في كل مكان في المختبر وdeubiquitination من بروتين H2A النيوكليوسومال. وتستخدم البروتينات المنقاة للبكتيريا التي يتم تجميعها في الحد الأدنى من المجمعات من RING1B/BMI1 و BAP1/DEUBAD لانتشار أو إلغاء يوبيكويتين من H2A النيوكليوسومال، على التوالي.
هناك العديد من المزايا لإنشاء قوية في المختبر في كل مكان واختبارات ديوبيكيتيشن للبروتينات ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه الاختبارات من أجل: ‘1’ تحديد الظروف المثلى وتحديد الحد الأدنى من المتطلبات لهذه التفاعلات، ‘2’ تحديد الثوابت الحركية والكيميائية الحيوية الأنزيمية، ‘3’ تحديد أدوار العوا…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ديانا أدجود على المساعدة التقنية. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (2015-2020)، وجينوم كيبيك (2016-2019) وجينوم كندا (2016-2019) إلى E.B.A. E.B.A. هو باحث كبير في مؤسسة بحوث كيبيك سانتي (FRQ-S). L.M وN.S.K. لديهم منحة الدكتوراه من FRQ-S. حصل سعادة على منحة دكتوراه من وزارة التعليم العالي ومن البحث العلمي في تونس ومؤسسة كول.
Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |