In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen
Summary
Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.
Abstract
Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen in verschillende signalering trajecten speelt en is met name betrokken bij de coördinatie van de chromatine functie en DNA-geassocieerde processen. Deze modificatie omvat een sequentiële werking van verschillende enzymen, waaronder E1 ubiquitin-activatie, E2 ubiquitin-conjugating en E3 ubiquitin-ligase en wordt omgekeerd door deubiquitinases (DUBs). Alomtegenwoordige werking induceert afbraak van eiwitten of wijziging van de eiwit functie, inclusief modulatie van enzymatische activiteit, eiwit-eiwit interactie en subcellulaire lokalisatie. Een kritieke stap bij het aantonen van de eiwit alomtegenwoordige of deubiquitatie is het uitvoeren van in vitro reacties met gezuiverde componenten. Effectieve Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties kunnen sterk worden beïnvloed door de verschillende gebruikte componenten, enzym co-factoren, buffer condities en de aard van het substraat. Hier bieden we stap-voor-stap protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties. We illustreren deze reacties met behulp van minimale componenten van de muis Polycomb repressieve complex 1 (PRC1), BMI1, en RING1B, een E3 ubiquitine ligase dat monoubiquitinates Histon H2A op lysine 119. Deubiquitisatie van nucleosomale H2A wordt uitgevoerd met behulp van een minimale Polycomb repressief Deubiquitinase (PR-DUB) complex gevormd door de humane deubiquitinase BAP1 en het DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domein van zijn co-factor ASXL2. Deze assays van alomtegenwoordige/deubiquitatie kunnen worden uitgevoerd in de context van recombinant nucleosomes die zijn gereconstitueerd met bacteriën gezuiverde eiwitten of inheemse nucleosomes die worden gezuiverd uit zoogdiercellen. We belichten de fijne kneepjes die een aanzienlijke impact kunnen hebben op deze reacties en we stellen voor dat de algemene principes van deze protocollen snel kunnen worden aangepast aan andere E3 ubiquitine ligasen en deubiquitinases.
Introduction
Ubiquitination is een van de meest geconcongeerde post-translationele modificaties en is van cruciaal belang voor een breed scala aan organismen, waaronder gist, planten en gewervelde dieren. Ubiquitination bestaat uit de covalente gehechtheid van ubiquitin, een zeer geconconeerd 76 aminozuur polypeptide, om eiwitten te richten en treedt op in drie opeenvolgende stappen waarbij drie enzymen zijn betrokken, d.w.z. E1-activerende, E2-conjugating en E3 ligase1, 2,3. Deze post-translationele modificatie speelt centrale rollen in een breed spectrum van biologische processen. Inderdaad, de E3 ligases, die de specificiteit van de reactie bieden, vormen een grote superfamilie van enzymen en zijn de meest voorkomende enzymen van het ubiquitine-systeem4,5,6. De downstream effecten van het ubiquitineren van eiwitten zijn afhankelijk van de aard van de modificatie: monoubiquitination, multi-monoubiquitinatie, en lineaire of vertakte polyubiquitination. Monoubiquitination wordt zelden geassocieerd met proteasomale afbraak, maar in plaats daarvan is deze modificatie betrokken bij het bemedieren van verschillende signalering van gebeurtenissen. Polyubiquitination omvat de N-terminal of de lysine residuen in de ubiquitine-molecule zelf, en de bestemming van een polyubiquitineerd eiwit hangt af van welk residu betrokken is bij ubiquitine Chain extension. Het is al lang bekend dat polyubiquitination gemedieerd door lysine 48 van ubiquitine induceert proteasomale afbraak. Integendeel, polyubiquitination via lysine 63 van ubiquitine wordt vaak geassocieerd met eiwit activatie7,8,9. Net als bij andere belangrijke post-translationele modificaties, is ubiquitisatie omkeerbaar en wordt ubiquitine verwijdering van eiwitten verzekerd door specifieke proteasen die deubiquitinases (DUBs) worden genoemd, die zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van cellulaire processen 2 , 10. belangrijk, veel Dubs zijn zeer gespecialiseerd, en reguleren, door deubiquitination, specifieke substraten, wat aangeeft dat een fijne balans tussen Ubiquitination en deubiquitination essentieel is voor de eiwit functie. E3s en Dubs vormen samen met de proteasoom degradatie machines en accessoire factoren het ubiquitin proteasoom systeem (UPS, met > 1200 genen) die de belangrijkste signalerings trajecten reguleert, waarvan er verscheidene geassocieerd worden met celgroei en proliferatie, bepaling van het lot van cellen, differentiatie, Celmigratie en celdood. Belangrijker is dat deregulering van verschillende signalering van Cascades met alomtegenwoordige ziekten tumorigenese en neurodegeneratie aandoeningen5,11,12,13, 14.
Ubiquitination speelt pervasieve rollen in de chromatide biologie en DNA-afhankelijke processen15,16,17. Bijvoorbeeld, monoubiquitination van Histon H2A op lysine 119 (hierna H2A K119ub) is een kritische post-translationele modificatie die betrokken is bij transcriptionele repressie en DNA-reparatie18,19,20, 21,22. H2A K119ub wordt gekatalyseerd door het repressieve complex van Polycomb 1 (PRC1), dat een sleutelrol speelt bij het onderhoud van epigenetische informatie en zeer goed wordt bewaard van Drosophila tot mens. Canonical PRC1 wordt met name gevormd door de RING1B en BMI1, die het kern-E3 ubiquitine ligase-complex zijn dat verantwoordelijk is voor de bovengenoemde Ubiquitination-gebeurtenis22,23. In Drosophilawordt H2A monoubiquitination (H2A K118ub dat overeenkomt met H2A K119ub in zoogdieren) omgekeerd door de Dub Calypso, die samenwerkt met extra Sex Comb (ASX) die de Polycomb-repressieve Dub (PR-Dub) complex24vormt. Het zoogdier ortholog van Calypso, BAP1, is een tumor suppressor verwijderd of geïnactiveerd in verschillende menselijke maligniteiten25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reguleert DNA-afhankelijke processen in de Nucleus en de door calcium-signalering gemedieerde apoptosis bij het endoplasmisch reticulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 assembleert multi-subunit eiwitcomplexen met transcriptie regelaars, met name ASXL1, ASXL2 en ASXL3 (asxls), drie orthologues van ASX38,43. Asxls gebruikt het domein deubiquitinase adapter (deubad), ook wel asxm Domain genoemd, om BAP1 Dub-activiteit te stimuleren35,36,44. Daarom speelt ASXLs belangrijke rollen bij het coördineren van BAP1 DUB-activiteit bij chromatine en meer in het algemeen zijn tumor suppressor-functie.
Er bestaan verschillende methoden om de processen van Ubiquitination en deubiquitination te bestuderen. Met name biochemische testen met behulp van eiwitten gezuiverd van bacteriën blijven zeer krachtig in het aantonen van directe alomtegenwoordige van, of verwijdering van ubiquitine van, specifieke substraten. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd om een reeks parameters te onderzoeken, zoals het bepalen van de eis van minimale complexen, het bepalen van reacties kinetiek, het definiëren van structuur/functie relaties en het begrijpen van de impact van pathologische gen mutaties. Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reacties op chromatine substraten met gezuiverde componenten. Als modelsysteem wordt in vitro Ubiquitination en deubiquitination van nucleosomale H2A eiwit gepresenteerd. Bacteriën-gezuiverde eiwitten geassembleerd in minimale complexen van RING1B/BMI1 en BAP1/DEUBAD worden gebruikt voor Ubiquitination of deubiquitinisatie van nucleosomale H2A, respectievelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende voordelen van het opzetten van robuuste in vitro Ubiquitination en deubiquitinisatie assays voor eiwitten van belang. Deze testen kunnen worden gebruikt om: (i) optimale omstandigheden vast te stellen en minimale vereiste voor deze reacties te definiëren, (II) enzymatische kinetische en biochemische constanten te bepalen, (III) de rollen te definiëren van cofactoren of remmers die deze reacties kunnen beïnvloeden, (IV) Identificeer interactie-interfaces, (v) test de impact van kunstmatige of ziek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Diana Adjaoud voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoeksraad van Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) en Genome Canada (2016-2019) tot E.B.A. E.B.A. is een senior geleerde van het Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L. M en N.S.K. hebben een doctoraats beurs van de FRQ-S. H. B had een doctoraats beurs van het ministerie van hoger onderwijs en van wetenschappelijk onderzoek van Tunesië en de Cole Foundation.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
References
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
