Identificación de receptores de orexina y endocannabinoides en peces cebra adultos mediante métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica clásica bien establecida utilizada para identificar componentes celulares o tisulares (antígenos) por interacción antígeno-anticuerpo^1,2. Se puede utilizar para identificar la localización y distribución de biomoléculas diana dentro de un tejido. IHC utiliza reacciones inmunológicas y químicas para detectar antígenos en las secciones³del tejido. Los principales marcadores utilizados para la visualización de interacciones antígeno-anticuerpos incluyen distículos fluorescentes (inmunofluorescencia)y reacciones de color enzima-sustrato (inmunoperoxidasa), ambos conjugados con anticuerpos 4. El uso de la observación microscópica es posible determinar la localización del tejido etiquetado, que corresponde aproximadamente a la localización del antígeno objetivo en el tejido.

Existen dos métodos para que las reacciones fluorescentes o cromogénicas detecten proteínas: el método de detección directa, en el que el anticuerpo primario específico se etiqueta directamente; y el método de detección indirecta, en el que el anticuerpo primario no se conjuga mientras que el anticuerpo secundario lleva la etiqueta^5,6,7. El método indirecto tiene algunas ventajas, que es principalmente su amplificación de señal. Además, a diferencia de otras técnicas moleculares y celulares, con inmunofluorescencia, es posible visualizar ladistribución, localización y coexpresión de dos o más proteínas expresadas diferencialmente dentro de las células y tejidos 7. La elección del método de detección utilizado depende de los detalles experimentales.

Hasta la fecha, IHC es ampliamente utilizado en la investigación básica como una herramienta poderosa y esencial para entender la distribución y localización de biomarcadores y el perfilado general de diferentes proteínas en el tejido biológico desde el ser humano hasta los invertebrados^{8, 9 , 10 , 11}. La técnica ayuda a mostrar un mapa de expresión proteica en un gran número de órganos animales normales y alterados y diferentes tipos de tejidos, mostrando una posible regulación hacia abajo o hacia arriba de la expresión inducida por cambios fisiológicos y patológicos. IHC es una técnica altamente sensible que requiere precisión y la elección correcta de métodos para obtener resultados óptimos¹². En primer lugar, muchos factores diferentes como la fijación, la reactividad cruzada, la recuperación de antígenos y la sensibilidad de los anticuerpos pueden conducir a señales falsas positivas y falsas negativas¹³. La selección de los anticuerpos es uno de los pasos más importantes en IHC y depende de la especificidad del antígeno y su afinidad con la proteína y las especies bajo investigación⁷.

Recientemente, hemos optimizado la técnica IHC para detectar miembros de sistemas de orexina/hipocretina y endocannabinoides en el tejido adulto de pez cebra. Nos hemos centrado principalmente en la fijación, la integración de tejidos utilizando dos enfoques diferentes, la sección y el montaje (que pueden afectar la resolución y el detalle durante el análisis microscópico), y el bloqueo (para prevenir falsos positivos y reducir el fondo)¹⁴. Otras características importantes son la especificidad de anticuerpos y la selectividad y reproducibilidad de los protocolos IHC individuales. La clave para proporcionar especificidad de anticuerpos es el uso de controles negativos (incluyendo ningún anticuerpo primario o tejido que se sabe que no expresa las proteínas diana) así como controles positivos (incluyendo tejido que se sabe que expresa las proteínas diana)¹⁵ . La selección de anticuerpos para IHC se realiza en función de su especificidad de especie (la probabilidad con la que reaccionan con el antígeno de interés) y los sistemas de detección de unión antígeno-anticuerpo que se utiliza^{4,5,6 ,7}. En el caso de la inmunoperoxidasa, el color de la reacción se determina mediante la selección del cromógeno precipitante, generalmente diaminobenzidina (marrón)^16. Por otro lado, immunofluorescence utiliza anticuerpos conjugados con un fluoróforo para visualizar la expresión de proteínas en secciones de tejido congelado y permite un fácil análisis de múltiples proteínas con respecto al sistema de detección cromogénica ^{5 , 7}.

En la técnica de la inmunoperoxidasa, el anticuerpo secundario se conjuga con la biotina, una molécula de vinculador capaz de reclutar una molécula de reportero cromogénico [complejo de biotina de avidina (ABC)], lo que conduce a la amplificación de la señal de tinción. Con el método de reportero ABC, la enzima peroxidasa reacciona con 3,3′-diaminobenzidina (DAB), produciendo una tinción intensamente de color marrón donde la enzima se une al anticuerpo secundario, que luego puede ser analizado con un microscopio de luz ordinario. La tinción ABC, debido a la alta afinidad de la avidina por la biotina, produce una reacción rápida y óptima, con pocos anticuerpos secundarios unidos al sitio de la reactividad primaria de anticuerpos. Este método de detección cromogénica permite el análisis densitométrico de la señal, proporcionando datos semicuantitativos basados en la correlación de los niveles de señal marrón con los niveles de expresión de proteínas^18.

Con las técnicas de inmunofluorescencia, la detección simultánea de múltiples proteínas es posible debido a la capacidad de diferentes fluorocromos para emitir luz a longitudes de onda únicas, pero es importante elegir los fluorocromos cuidadosamente para minimizar la superposición ^{espectral 5}. Además, el uso de anticuerpos primarios en diferentes especies anfitrionas minimiza las dificultades relativas a la reactividad cruzada. En este caso, cada anticuerpo secundario específico de la especie reconoce sólo un tipo de anticuerpo primario. Los reporteros fluorescentes son moléculas orgánicas pequeñas, incluyendo derivados comerciales, como los tintes Alexa Fluor.

Muchos modelos animales se utilizan para entender condiciones fisiológicas y patológicas particulares. Hasta la fecha, se ha establecido que muchas vías metabólicas se conservan a lo largo de la evolución. Por lo tanto, los estudios de IHC en organismos modelo como el pez cebra pueden proporcionar información sobre la génesis y el mantenimiento de las condiciones patológicas y no patológicas^17. El objetivo de este informe es ilustrar los protocolos IHC que se pueden realizar en el tejido adulto de pez cebra y utilizarse para obtener imágenes detalladas de la distribución y localización de OXA, OX-2R y CB1R a nivel periférico y central. También se informa nifiquen los protocolos para la aplicación de dos métodos indirectos principales de IHC en los tejidos periféricos y centrales del pez cebra adulto. Se describe el método indirecto, que permite la amplificación de la señal en los casos en que un anticuerpo secundario se conjuga con un tinte fluorescente (método de inmunofluorescencia) o un reportero enzimático (método de inmunoperoxidasa). Los métodos de detección cromogénicos y fluorescentes poseen ventajas y desventajas. En este protocolo se informa el uso de IHC, principalmente inmunofluorescencia, en el pez cebra adulto, un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar sistemas que se conservan evolutivamente en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.