Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica
Summary
Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.
Abstract
Os exosomas e outras vesículas extracelulares (EVs) são complexos moleculares constituídos por uma vesícula de membrana lipídica, sua decoração superficial por proteínas de membrana e outras moléculas, e conteúdo Luminal diverso herdado de uma célula-mãe, que inclui RNAs, proteínas e DNAs. A caracterização dos tamanhos hidrodinâmicos de EVs, que depende do tamanho da vesícula e da sua camada coronal formada por decorações superficiais, tornou-se rotineira. Para os exosomas, o menor dos EVs, a diferença relativa entre os tamanhos hidrodinâmico e vesículas é significativa. A caracterização de tamanhos de vesículas pela imagem de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM), uma técnica de padrão-ouro, continua sendo um desafio devido ao custo do instrumento, a expertise necessária para realizar a preparação da amostra, a imagem e análise de dados, e um pequeno número de partículas muitas vezes observadas em imagens. Uma alternativa amplamente disponível e acessível é a microscopia de força atômica (AFM), que pode produzir dados versáteis sobre geometria tridimensional, tamanho e outras propriedades biofísicas de vesículas extracelulares. O protocolo desenvolvido orienta os usuários na utilização desta ferramenta analítica e delineia o fluxo de trabalho para a análise de EVs pelo AFM, que inclui a preparação da amostra para exames de imagem em forma hidratada ou desictada, a imobilização eletrostática de vesículas em um substrato, aquisição de dados, sua análise e interpretação. Os resultados representativos demonstram que a fixação de EVs na superfície modificada da mica é previsível, customizável, e permite que o usuário obtenha resultados da cola para um grande número vesículas. O dimensionamento de vesículas com base nos dados de AFM foi encontrado para ser consistente com a imagem latente de Cryo-TEM.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) estão presentes em todos os fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite e o líquido amniótico. Os exosomas formam uma classe distrital de EVs diferenciada de outros EVs por biogênese endossômica, os marcadores da via endossômica e o menor tamanho entre todos os EVs. O tamanho dos exosomas é relatado frequentemente com variabilidade substancial entre estudos. Os resultados de dimensionamento foram encontrados como dependentes do método, refletindo a diferença nos princípios físicos empregados por diferentes técnicas analíticas para estimar ostamanhos de EV1,2. Por exemplo, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ― a técnica de caracterização de tamanho mais amplamente utilizada ― estima o tamanho dos EVs como seus diâmetros hidrodinâmicos, que caracterizam a resistência à mobilidade browniana de EVs na solução. Um diâmetro hidrodinâmico maior de uma vesícula implica sua menor mobilidade em líquido. A camada coronal em torno das vesículas, consistindo de proteínas superficiais e outras moléculas ancoradas ou adsortas à superfície da membrana, impede substancialmente a mobilidade e aumenta o tamanho hidrodinâmico dos EVs. Em termos relativos, esse aumento é particularmente grande para os exosomas3, como ilustrado na Figura 1.
A imagem latente da microscopia de elétron de transmissão criogênica (Cryo-tem) é uma técnica definitiva em caracterizar tamanhos e morfologia do vesícula em seus Estados hidratados. No entanto, o alto custo da instrumentação e a expertise especializada necessária para utilizá-lo motivam corretamente a exploração de técnicas alternativas que podem ser imagens hidratadas. Um número relativamente pequeno de EVs observado ou caracterizado nas imagens adquiridas de Cryo-TEM é uma outra desvantagem notável desta técnica.
A microscopia da força atômica (AFM) visualiza a topografia tridimensional de EVS hidratados ou Desiccated4,5,6escaneando uma ponta deprova através da carcaça para rasterear a imagem das partículas na superfície. Os passos essenciais do protocolo para caracterizar os EVs por AFM estão descritos neste estudo. Antes de imagem as vesículas em líquido, eles devem ser imobilizados em um substrato, quer amarrar a uma superfície funcionalizada, aprisionamento em um filtro, ou por atração eletrostática7. A fixação eletrostática em um substrato positivamente carregado é uma opção particularmente conveniente para a imobilização de exosomas conhecidas por ter um potencial zeta negativo. No entanto, as mesmas forças eletrostáticas que imobilizam as vesículas extracelulares na superfície também distorcem sua forma, o que torna essencial a análise de dados pós-imagem. Elaboramos este ponto descrevendo o algoritmo que estima o tamanho das vesículas globulares na solução com base nos dados da AFM sobre a forma distorcida dos exosomas imobilizados na superfície.
No protocolo desenvolvido, o procedimento para a imobilização eletrostática robusta de vesículas é apresentado e seguido pelas etapas necessárias para a realização de imagens de força atômica nos Estados hidratados ou desictados. Os fatores que influenciam a concentração superficial das vesículas imobilizadas são identificados. A orientação é dada sobre como realizar a imobilização eletrostática para amostras com diferentes concentrações de EVs na solução. Discute-se a seleção de condições experimentais que permitam estimar as distribuições de probabilidades empíricas de diferentes propriedades biofísicas com base em um número suficientemente grande de vesículas imobilizadas. Exemplos de análise pós-imagem dos dados do AFM são fornecidos. Especificamente, um algoritmo é descrito para determinar o tamanho das vesículas na solução com base na caracterização AFM de EVs imobilizados. Os resultados representativos mostram a consistência do dimensionamento de vesículas por AFM com os resultados da imagem latente de Cryo-TEM.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imobilização de EVs de um líquido biológico, de uma exploração de superfície, e de uma análise da imagem é as etapas essenciais do protocolo desenvolvido para a caracterização de AFM dos EVs no líquido. O número de vesículas em escalas de imagem AFM com a área de superfície imaged e a concentração superficial das vesículas imobilizadas no substrato. Dado um potencial zeta negativo de EVS e de exossomos18, nós advogamos a fixação eletrostática dos EVS das amostras líquidas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio financeiro da National Science Foundation (número de prêmio IGERT-0903715), da Universidade de Utah (departamento de engenharia química Seed Grant e do prêmio de bolsa de estudos de pós-graduação), e Skolkovo Institute of Science e tecnologia (Skoltech Fellowship).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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