원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰
Summary
단계별 절차는 액체 견본에서 엑소좀 및 세포외 소포의 표지 자유로운 고정을 위해 기술되고 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의하여 그들의 화상 진찰. AFM 이미지는 용액에서 소포의 크기를 추정하고 다른 생물 물리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.
Abstract
엑소좀 및 기타 세포외 소포(EV)는 지질막 소포, 막 단백질 및 기타 분자에 의한 표면 장식, RNA를 포함하는 모세포로부터 상속된 다양한 발광 량으로 구성된 분자 복합체이며, 단백질, 및 DNA. 소포의 크기와 표면 장식에 의해 형성된 관상 층의 크기에 따라 달라지는 전기 자동차의 유체 역학적 크기의 특성화는 일상화되었습니다. 엑소좀, 전기 의 가장 작은, 유체 역학 과 소포 크기 사이의 상대적 차이는 중요하다. 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 이미징에 의한 소포 크기의 특성화는 금 본위제 기술인 금본위제 기술로 인해 기기 의 비용, 시료 준비, 이미징 및 이미지에서 관찰되는 소수의 입자를 분석합니다. 널리 이용가능하고 접근 가능한 대안은 3차원 기하학, 크기 및 세포외 소포의 그밖 생물물리학적 특성에 대한 다양한 데이터를 생성할 수 있는 원자력 현미경 검사법(AFM)입니다. 개발된 프로토콜은 사용자가 이 분석 도구를 활용하게 하는 데 지침이 되며, AFM에 의한 전기자동차 분석을 위한 워크플로우를 간략하게 설명하며, 여기에는 수화 또는 건조 형태로 이미징 EV를 위한 샘플 준비, 정전기 적 고정화 고정화 기판, 데이터 수집, 분석 및 해석에 대한 소포. 대표적인 결과는 수정된 운소 표면에 전기 를 고정하는 것이 예측 가능하고 사용자 정의 가능하며 사용자가 많은 수의 소포에 대한 크기 조정 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. AFM 데이터에 기초한 소포 크기 조정은 저온-TEM 이미징과 일치하는 것으로 나타났다.
Introduction
세포밖 소포 (EV)는 혈액, 소변, 타액, 우유 및 양수를 포함하여 모든 체액에서 존재합니다. 엑소좀은 내생 생물발생, 내생 통로의 마커, 모든 EV 중 가장 작은 크기로 다른 EV와 차별화된 지역 형 EV 클래스를 형성합니다. 엑소좀의 크기는 종종 연구 사이 상당한 가변성으로 보고됩니다. 상기 크기 조정 결과는 EV 크기를 추정하기 위해 상이한 분석 기법에 의해 채택된 물리적 원리의 차이를 반영하여 EV 크기1,2를반영하는 방법에 의존하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 크기 특성 화 기법인 나노 입자 추적 분석(NTA)은 용액에서 EV의 브라운 이동성에 대한 저항성을 특징짓는 유체역학적 직경으로 EV의 크기를 추정합니다. 소포의 더 큰 유체 역학 직경은 액체에서 낮은 이동성을 의미합니다. 표면 단백질 및 멤브레인 표면에 고정되거나 흡착된 다른 분자로 구성된 소포 주위의 관상 층은 이동성을 실질적으로 방해하고 전기 EV의 유체 역학적 크기를 증가시킵니다. 상대적인 측면에서, 이러한 증가는 그림 1에도시된 바와 같이 엑소좀3에대해 특히 크다.
극저온 투과 전자 현미경 검사법 (cryo-TEM) 화상 진찰은 그들의 수화한 상태에서 소포 크기 및 형태를 특성화하는 결정적인 기술입니다. 그러나 계측기의 높은 비용과 이를 사용하는 데 필요한 전문 지식은 수화된 전기 를 이미지화할 수 있는 대체 기술의 탐구에 정확하게 동기를 부여합니다. 획득된 극저온-TEM 이미지에서 관찰되거나 특징지어지는 비교적 적은 수의 EV는 이 기술의 또 다른 주목할 만한 단점이다.
원자력 현미경 검사법(AFM)은 표면에 입자의 이미지를 래스터하기 위해 기판을 가로질러 프로브를 스캐닝함으로써 수화 또는 건조된 EV4,5,6의 3차원 지형을 시각화한다. AFM에 의해 전기 를 특성화하는 프로토콜의 필수 단계는이 연구에서 설명되어 있습니다. 액체에 소포를 이미징하기 전에, 그들은 기능화 된 표면에 테더링, 필터에 트래핑, 또는 정전기 인력7에의해 기판에 고정되어야한다. 양전하 기판상정전기 고정은 음의 제타 전위를 가지는 것으로 알려진 엑소좀의 고정화를 위한 특히 편리한 옵션이다. 그러나 표면에 세포외 소포를 고정시키는 동일한 정전기력도 모양을 왜곡하여 이미징 후 데이터 분석이 필수적입니다. 우리는 표면에 고정 된 엑소좀의 왜곡 된 모양에 AFM 데이터를 기반으로 솔루션의 구형 소포의 크기를 추정하는 알고리즘을 설명하여이 점을 정교하게.
개발 된 프로토콜에서 소포의 강력한 정전기 고정을위한 절차가 제시되고 수화 또는 건조 된 상태에서 원자력 이미징을 수행하는 데 필요한 단계가 뒤따릅니다. 고정된 소포의 표면 농도에 영향을 미치는 요인이 확인됩니다. 이 지침은 용액에서 서로 다른 농도의 EV를 가진 시료에 대한 정전기 고정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 충분히 많은 수의 고정된 소포에 기초하여 상이한 생물물리학적 성질의 경험적 확률 분포의 추정을 허용하는 실험 조건의 선택이 논의된다. AFM 데이터의 사후 이미징 분석의 예가 제공됩니다. 구체적으로, 고정화 EV의 AFM 특성화에 기초하여 용액내 소포의 크기를 결정하기 위한 알고리즘이 설명된다. 대표적인 결과는 극저온-TEM 이미징의 결과와 AFM에 의한 소포 크기 조정의 일관성을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생물학적 유체, 표면 스캐닝 및 이미지 분석에서 전기 EV의 고정은 액체에서 EV의 AFM 특성화를 위한 개발된 프로토콜의 필수 단계입니다. AFM 이미징 스케일에 대한 소포의 수는 기판 상에 고정된 소포의 표면적 및 표면 농도를 갖는다. 전기 자동차및 엑소좀18의부정적인 제타 전위를 감안할 때, 우리는 액체 샘플에서 AFM 기판에 이르기까지 전기 전기 적 고정을 옹호합니다. 고정은 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 과학 재단 (수상 번호 IGERT-0903715), 유타 대학 (화학 공학 종자 보조금 및 대학원 연구 펠로우십 상), 그리고 과학의 스콜코보 연구소의 재정 지원을 인정 기술 (스콜테크 펠로우십).
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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