Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Birden çok platform epigenome düzenleme son zamanlarda herhangi bir DNA dizileri gene expression^1,2kontrol bölgeleri hedeflemek için geliştirilmiştir. Oluşturulan epigenome düzenleme araçları (i) transkripsiyon düzenleyen, (II) alter ardından Histon değişiklikler, (III) DNA metilasyonu değiştirmek ve (iv) düzenleyici öğe etkileşimleri modüle için tasarlanmıştır. Devre dışı bırakılan bir (ölü) Cas9 için transkripsiyon/Kromatin değiştiriciler tutturmak yaklaşım (dCas9) yükseltilmiş üzerinden daha önce çinko gibi epigenome düzenleme Gelişmiş platformlar parmak proteinleri (ZFPs) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi effectors (hikayeler), güçlü transkripsiyon efektör etki alanı barındıran (ED) tasarlanmış DNA’ya bağlanıcı etki alanına (DBD)³erimiş. Etkinleştirme veya baskı gibi istenen fenotip sonucunu endojen loci (şekil 1) demirlemiş efektör molekül tarafından tanımlanır. Programlanabilir transkripsiyon aktivatörleri oluşturmak için dCas9/gRNA modülleri VP16^4,5,–⁶ (şekil 1A), Pol II ve genel transkripsiyon makine acemi bir viral harekete geçirmek etki alanına bağlıdır. Bu sistem modifikasyonu bile daha sağlam bir etkinleştirme oranı^5,6sağlayan VP64, bir tetramer VP16 alanlarının yer verdi. Sistem başarıyla rehberleri ve onların düzenleyici elemanlarının hedefleyerek kodlama ve kodlamayan bölgeler etkinleştirmek için istihdam edilmiştir. VP64 molekülleri doğrudan hedef bölge Kromatin yapısında değişiklik yapmayın olsa bile, önemlisi, H3/H4 asetilasyon ve H3-K4 di da dahil olmak üzere etkin (euchromatin) işaretleri birikimi içinde sonuçları bağlama Kromatin değiştiriciler acemi / Tri-metilasyonu^5,6. VP64 ek olarak, insan NF-κB kompleks p65 alt birim için dCas9/gRNA modül⁷gergin. İlginçtir, bu effectors bölgelere akıntıya karşı transkripsiyon başlangıç siteleri (TSSs) ve rehberleri içinde hayvan zinciri bir güçlü gen indüksiyon sonuçlanır. Yine de, VP64 ve p65 effectors da activatory etkileri uygulamayın aşağı TSSs ve distal arttırıcılar^7,8bulunan bölgelere bağlı iken. Daha sağlam bir transkripsiyon yanıt temin için birden çok dCas9-VP64 veya dCas9-p65 füzyon bir tek hedef locus^9,10‘ a işe gerekir. Bu nedenle, birden çok efektör etki alanı SunTag gibi bir tek dCas9-gRNA kompleksi tarafından işe yeni nesil harekete geçirmek son gelişmeler bir daha güçlü harekete geçirmek yetenek dCas9-VP64 füzyon karşılıkları¹¹ ‘ e karşılaştırarak sonuçlandı ^{, 12}. geliştirilmiş bir transkripsiyon etkinleştirme VP64, p65 ve Rta (VPR), C-terminus dCas9¹³ (şekil 1A) için gama-herpesviruses, bir transactivation etki alanı füzyon yoluyla elde etti. Benzer CRISPR/dCas9 sistemleri hedef özel baskı (şekil 1B) için geliştirilmiştir.

Endojen gen baskı mühendislik önleyici füzyon ile çeşitli mekanizmalar (şekil 1B) elde edilebilir. CRISPR/dCas9 sistemleri, önleyici DBD (bile olmadan bir efektör etki alanı/sn), bağlantılı verimli bir organizatörü veya akış yukarı/aşağı-TSS bölgeleri^3,–^{6 gergin iken gen ekspresyonu sessizlik gösterilmiştir ,14}. Transkripsiyon üzerindeki etkileri transkripsiyon faktörü bağlama ve RNA polimeraz işleme steric girişim tarafından neden oldu. Yine de, daha kapsamlı yaklaşımlar gerekli, steric engel yalnız gen baskı kez sağlam susturmak için yeterli değil gibi. Susturucular yeni nesil son geliştirme tabanlı transkripsiyon önleyici etki alanları (TRDs), Histon değiştiriciler taşıyan CRISPR/dCas9 sistemler üzerinde (H3-K9 di-/ tri-metilasyonu, H3-K27 di-/ tri-metilasyonu; H3-K36 di-/ tri-metilasyonu, H3/H4 deasetilasyonu) ve etkileri^{4,5,15,16, susturmak daha sağlam izin epigenetik araçlar inşaat için liderliğindeki (KSY) DNA metilasyonu 17,18,19,20}. Bu epigenetik değiştiricileri için DNA alımı genellikle bir daha güçlü silencing sonucu^21,22oluşturmak daha fazla kapalı ve yoğun Kromatin oluşumu için neden olabilir kanıtlanmıştır. DBDs ile kullanılan en yaygın silencing etki alanını Krüppel ilişkili kutusu (KRAB)^4,5‘ tir. Faktör alımı Kromatin değişikliklerle karşılık göstermiştir; Bununla birlikte, bu değişiklikler mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır^16,17,18olmak vardır. Son zamanlarda, bu KRAB DNA için yerelleştirme Histon metiltransferaz SETDB1 ve Histon deasetilasyonu (HDAC) NuRD kompleksleri, bu etkileşimler oluşumuna aracılık olasılığını ima kurul yükseltebilirsiniz gösterilmiştir Kromatin yoğunlaşma ve transkripsiyon susturmak^3,13. Alternatif bir yaklaşım efektör etki alanları DBDs için özel bir epigenetik silencing protein oluşturmak için erimiş. Bu sistem doğrudan baskıcı DNA işaretleri veya Histon değişiklikler tromboksan.

DNMT3A enzim kaşif Balonlu keşif sentetik CRISPR/dCas9 sistemlerinin kullanımı son zamanlarda, transkripsiyon deaktivasyon için repurposed. DNMT3A endojen gen rehberleri ve diğer düzenleyici bölgeleri (şekil 1B)^18,20heterochromatin oluşumu boyunca transkripsiyon baskı giderek artan DNA metilasyonu tromboksan. McDonald et al.¹⁸ ve Vojta vd.²⁰ DNA metilasyonu epigenome-gen susturmak veya baskı, plazmid teslim dCas9-DNMT3A fusion sistemi kuvvetli artırabilir gösteren için kullanılabilir rapor için ilk yazarlar vardı sitozin metilasyonu TSS^18,20civarında. McDonald ve iş arkadaşlarınızın istihdam stratejisinin önemli bir azalma (yaklaşık % 40) neden olabilir gösterdi bir Tümör baskılayıcı gen CDKN2A mRNA¹⁸düzeyleri. Benzer şekilde, BACH veya IL6ST genlerin bazlar organizatörü bölge hedefleme gen ifade²⁰iki kat azalma ile ilişkili artan CpG metilasyonu gösterir. Laboratuarımızın son zamanlarda SNCA overexpression (Şekil 2)²³patolojik sonuçlar inceltiyorum için DNA metilasyonu kullanımı repurposed. Daha önce hypomethylated PD ve demans Lewy organları (DLB) beyin^{24,25olduğu bildirilen gibi strateji DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölgede seçici geliştirme dayanır, 26}. Bu hypomethylation SNCA overexpression, böylece terapötik müdahale^24,27,28için cazip bir hedef sunan bağlı. Biz son zamanlarda SNCA intron 1 hiPSC kaynaklı dopaminerjik NPCs bölgede bir PD hasta SNCA triplication²³ile elde edilen DNA metilasyonu düşük düzeyde gösterdi. Bu deneysel model NPCs sağlam kültüründe yayılır veya daha fazla olgun nöronların hücresel fenotipleri oksidatif dahil olmak üzere, arabuluculuk genetik faktörlerin tanımlamak etkili bir tarama etkinleştirme ayrıştırılan avantajdır stres ve Apoptozis²⁹. Ayrıca, bu modeli sistem belirti başlangıçlı hastalarda önce gelişim olayları özetlemek bilim adamları sağlar. Buna ek olarak, hiPSC elde edilen NPCs gen ekspresyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler yollar test etmek için harika bir araç temsil eder. Önemlisi, state-of–art CRISPR/Cas9-epigenome teknoloji ile birlikte hiPSC elde edilen NPCs büyük ölçüde ilaçların”yeni nesil” pek çok nörodejeneratif hastalıklar için geliştirme kolaylaştırabilir.

Biz son zamanlarda bir dCas9-DNMT3A füzyon proteini ve gRNA için özel olarak hedef CpG metilasyonu SNCA intron 1 (şekil 2A) içinde taşıyan lentivirus tabanlı bir sistemin SNCA ifade patolojik düzeyde azaltmak için geliştirilen²³. Bu iletişim kuralı lentiviral vektör (LV) tasarım ve üretim ayrıntılı olarak açıklanmıştır. CRISPR/dCas9 bileşenleri çeşitli nedenlerden ötürü teslim etmek için etkili bir yol LVs temsil, yani hantal DNA yürütmek için (i) kendi kapasitesi ekler, hücre bölünmesi ve nondividing hücreleri^{30 da dahil olmak üzere, geniş bir transducing (II) bir yüksek verimlilik} ve (iii) yeteneklerini en az sitotoksik ve immünojenik yanıt-e doğru uyarmak için. Son zamanlarda, LV sistem SNCA locus triplication ile bir hastadan hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron için uygulanan ve LVs tedavi potansiyelini’dır epigenome düzenleme gösterdi metilasyonu²³ ( araçları Şekil 2B). Gerçekten de, bir LV-gRNA/dCas9-DNMT3A sistemi DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölge, önemli bir artış neden olur. Bu artış SNCA mRNA ve protein²³düzeyde azalma ile karşılık gelir. Ayrıca, SNCA downregülasyon PD ile ilgili fenotipleri SNCA triplication/hiPSC-türetilmiş dopaminerjik nöron (örneğin, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı)²³yılında kurtarır. Önemlisi, biz gösterdi SNCA ifade LV-gRNA-dCas9-DMNT3A sistem tarafından azalma hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron taşıyan bir PD hastadan için karakteristik olan fenotipleri geri yeteneğine SNCA triplication, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı²³gibi. Bu iletişim kuralı 1) üretim Protokolü ve konsantrasyon viral hazırlıklar yüksek tittered oluşturmak için en iyi duruma getirilmiş bir LV platformu belirlemenizi ve 2) hiPSCs farklılaşma olgun dopaminerjik olmak için desenli NPCs içine açıklamak için hedeftir nöronlar^31,32 ve SNCA intron 1 hedeflenen bölgeye metilasyon düzeyi karakterizasyonu.

Lentiviral platformlar eski büyük genetik ekler^33,34uyum yeteneği olan yani adeno ilişkili vektörel çizimler (AAVs), en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaj var. AAVs önemli ölçüde daha yüksek verim-ebilmek var olmak oluşturmak ama düşük paketleme kapasitesine sahip (< 4,8 kb), All-In-one CRISPR/Cas9 sistemleri sunmak için bunların kullanımı ödün. Böylece, görünüşe göre LVs platformu-in-seçimi CRISPR/dCas9 araçların teslimi ilgili uygulamalarda olurdu. Bu nedenle, burada özetlenen Protokolü hücre ve organların epigenome düzenleme bileşenleri etkin bir şekilde teslim etmek isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olacak. Daha fazla iletişim kuralı vektörel çizimler vektör ifade kaset^30,35içindeki öğeler CIS içinde bir değişiklik ile üretim ve ifade yeteneklerini artırmak için strateji özetliyor. Strateji dayanır romanından sistem geliştirdi ve bizim laboratuarımızda okudu ve 10¹⁰ viral adet (VU) /mL^30,35aralığında viral parçacıkların üretmek için onun yetenek vurgulamaktadır.