Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Adult Neurogenesis ist ein biologischer Prozess, durch den neue Neuronen in einem Erwachsenen geboren und in die bestehenden neuronalen Netzwerke integriert werden¹. Beim Menschen findet dieser Prozess im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus statt, wo täglich etwa 1.400 neue Zellen geboren werden². Diese Zellen befinden sich im inneren Teil der DG, der eine neurogene Nische, die so genannte subgranulare Zone (SGZ), beherbergt. Hier durchlaufen hippocampale adulte neuronale Stammzellen (NSCs) einen komplexen Entwicklungsprozess, um voll funktionsfähige Neuronen zu werden, die zur Regulierung spezifischer Gehirnfunktionen beitragen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, Stimmungsregulierung und Stressreaktion^{3 ,4,5,6}. Um das Verhalten zu beeinflussen, werden erwachsene NSCs durch verschiedene externe Reize in einer aktivitätsabhängigen Weise stark reguliert, indem sie auf eine Reihe lokaler und distaler chemischer Hinweise reagieren. Diese chemischen Hinweise umfassen Neurotransmitter und Neuromodulatoren und handeln in einer Schaltung spezifische Weise aus verschiedenen Gehirnregionen. Wichtig ist, dass die kreisweite Konvergenz dieser chemischen Hinweise auf NSCs eine einzigartige und präzise Regulierung von Stammzellaktivierungs-, Differenzierungs- und Schicksalsentscheidungen ermöglicht.

Eine der effektivsten Möglichkeiten, die Schaltungsregulierung von erwachsenen NSCs in vivo abzuhören, besteht darin, die Immunfluoreszenzanalyse mit kreisweiten Manipulationen zu koppeln. Die Immunfluoreszenzanalyse von nSCs für Erwachsene ist eine häufig verwendete Technik, bei der Antikörper gegen bestimmte molekulare Marker verwendet werden, um das Entwicklungsstadium von nSCs für Erwachsene anzuzeigen. Zu diesen Markern gehören: Nestin als radiale Gliazelle und früher neuronaler Vorläufermarker, Tbr2 als zwischengeschalteter Vorläufermarker und dcx als Neuroblast und unreifer Neuronenmarker⁷. Zusätzlich können durch die Verabreichung von Thymidin-Analogen wie BrdU, CidU, Idu und Edu Zellpopulationen, die sich der S-Phase unterziehen, individuell beschriftet und visualisiert werden^8,9,10. Durch die Kombination dieser beiden Ansätze kann eine breite Palette von Fragen untersucht werden, die von der Art und Weise, wie die Proliferation in bestimmten Entwicklungsstadien reguliert wird, bis hin zur Wirkung verschiedener Hinweise auf die NSC-Differenzierung und Neurogenese reichen.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, neuronale Schaltkreise effektiv zu manipulieren, einschließlich elektrischer Stimulation, Optogenetik und Chemogenetik, jeder mit seinen eigenen Vor- und Nachteilen. Die elektrische Stimulation beinhaltet eine umfangreiche Operation, bei der Elektroden in eine bestimmte Hirnregion implantiert werden, die später verwendet werden, um elektrische Signale zu übertragen, um eine zielgerichtete Hirnregion zu modulieren. Dieser Ansatz fehlt jedoch sowohl der zellulären als auch der Schaltungssspezifität. Optogenetik beinhaltet die Lieferung von viralen Partikeln, die einen Licht-aktivierten Rezeptor kodieren, der durch einen Laser stimuliert wird, der durch eine implantierte optische Faser emittiert wird, aber umfangreiche Manipulationen, hohe Kosten und komplexe Operationen erfordert¹¹. Chemogenetik beinhaltet die Abgabe von Viruspartikeln, die einen Designerrezeptor kodieren, der ausschließlich durch Designermedikamente oder DREADDs aktiviert wird, die anschließend durch einen spezifischen und biologisch inerten Liganden, bekannt als Clozapin-N-Oxid (CNO)^12, aktiviert werden. . Der Vorteil der Verwendung von DREADDs zur Manipulation lokaler neuronaler Schaltkreise, die erwachsene NSCs regulieren, liegt in der Leichtigkeit und den verschiedenen Wegen der CNO-Administration. Dies ermöglicht einen weniger zeitaufwändigen Ansatz mit reduzierter Tierhandhabung, der für Langzeitstudien leicht anpassungsfähig ist, um neuronale Schaltkreise zu modulieren.

Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz ist eine umfassende Sammlung verschiedener Protokolle, die erforderlich sind, um die Schaltkreisregulierung der erwachsenen Hippocampus-Neurogenese erfolgreich abzuhören, die sowohl Immunfluoreszenztechniken als auch Schaltungsmanipulationen kombiniert. Chemogenetik. Die im folgenden Protokoll beschriebene Methode eignet sich zur Stimulierung oder Hemmung eines oder mehrerer Schaltkreise gleichzeitig in vivo, um ihre regulatorische Funktion auf die adulte Neurogenese zu bestimmen. Dieser Ansatz wird am besten verwendet, wenn die Frage nicht ein hohes Maß an zeitlicher Auflösung benötigt. Fragen, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Stimulation/Hemmung bei einer bestimmten Frequenz erfordern, können besser mit der Optogenetik^13,14behandelt werden. Der hier beschriebene Ansatz ist leicht für Langzeitstudien mit minimalem Umgang mit Tieren geeignet, insbesondere dort, wo Stress ein großes Anliegen ist.