Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر
Summary
التقنيات التقليدية المستندة إلى كدنا overexpression انطباقاً محدودا overexpression الكشف فضله منذ فترة طويلة بسبب أشكالها لصق متعددة مع الوظائف المحتملة. هذا الاستعراض تقارير بروتوكول باستخدام تكنولوجيا كريسبر إلى أوفيريكسبريس متعددة المتغيرات لصق الحمض النووي الريبي فضله منذ وقت طويل.
Abstract
منذ فترة طويلة فضله الحمض النووي الريبي (لنكرنا) البيولوجيا حقل جديد ومثير للبحوث، مع عدد المنشورات من هذا الحقل تزايد أضعافاً مضاعفة منذ عام 2007. هذه الدراسات قد أكدت على أن يتم تغيير لنكرناس في تقريبا جميع الأمراض. بيد دراسة الأدوار الوظيفية لنكرناس في سياق المرض لا يزال صعباً بسبب عدم وجود منتجات البروتين، التعبير الخاصة بالانسجة، مستويات منخفضة من التعبير، والتعقيدات في لصق الأشكال، وعدم الحفظ فيما بين الأنواع. نظراً للتعبير إبلاغها، دراسات لنكرنا غالباً ما تنحصر في سياقات البحوث البشرية عند دراسة عمليات المرض. حيث تعمل لنكرناس على المستوى الجزيئي، هو طريقة واحدة لتشريح الأحياء لنكرنا إزالة لنكرنا أو أوفيريكسبريس لنكرنا وقياس آثار الخلوية. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مكتوب وتصور أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. كتجربة ممثل، يرد لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، انترفيرون غاما Antisense 1 (إيفنج-AS1)، أن overexpressed في نموذج جوركات تي خلية. لإنجاز هذا، استخدام التقنية يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) بتفعيل متفاوت المسافات لتمكين أوفيريكسبريشن في المكاني الجينوم الذاتية. التقنية كريسبر تفعيل الأهداف مجموعة من عوامل النسخ إلى موقع بدء النسخي الجينات، تمكن overexpression قوية متعددة الأشكال لصق لنكرنا. هذا الإجراء سيتم تقسيمها إلى ثلاث خطوات، هي: (ط) دليل الحمض النووي الريبي (جرنة) التصميم وناقلات البناء والجيل (الثاني) فيروس وتوصيل والفرز (ثالثا) مستعمرة ل overexpression. لهذه التجربة التمثيلية، أكبر مما لوحظ تعزيز برنامج في IFNG-AS1 في خلايا تي جوركات.
Introduction
حين ركزت البحوث الطبية الحيوية الأكثر على نصوص ترميز البروتين، يتألف غالبية الجينات يدون فعلا الكشف فضله (الإصدار انسيمبل 93). البحث الحالي هو بداية لاستكشاف هذا المجال، مع عدد المنشورات بشأن لنكرناس في عمليات المرض ترتفع أضعافاً مضاعفة بين 2007 و 20171. هذه المنشورات تبين أن الكثير من لنكرناس ترتبط بالمرض. ومع ذلك، يصعب الآليات الجزيئية لهذه لنكرناس من الدراسة بسبب وظائفها المتنوعة بالمقارنة مع مرناس. مما يضاعف من مشكلة فهم دور لنكرناس في المرض، لنكرناس غالباً ما يعبر عنها مستويات أدنى من الترميز الكشف2. بالإضافة إلى ذلك، لنكرناس هي سيئة حفظت، مما يحد من الدراسات الفنية في تقنيات الإنسان-خط-يستند إلى الخلية3. أسلوب واحد لدراسة إليه هذه الجينات الجديدة اندوجينوسلي أوفيريكسبريس لهم في الخلايا المستزرعة. الدراسات overexpression يمكن أن توفر معلومات أساسية بشأن الوظيفة الجينات محددة وتمكن الباحثين من تشريح المسارات الجزيئية الرئيسية.
يستند أسلوب جديد لتفعيل نسخ جينات لنكرنا كريسبر التقنيات المتقدمة في البداية المختبرات جيرسباتش4. هذا البروتوكول قد تم تكييفها للاستخدام في علم الأحياء لنكرنا و للتعبير عن هذه الجينات في نظم نموذجية أخرى. في كريسبر overexpressing تقنية، بروتين يسمى البروتين المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) يمكن أن توجه نحو تسلسل الحمض النووي عن طريق جرنة العقاقير يتم التعرف عليه بواسطة Cas9. عادة، سوف تحفز Cas9 الانقسام والحمض النووي؛ ومع ذلك، إلغاء الطفرات في Cas9، سبق أن وضعت لهذه التقنية أوفيريكسبريشن، هذه الخطوة5. عندما يتم تنصهر فيها منشط النسخي Cas9 “ميتة” (dCas9)، ويمكن أن overexpression الذاتية من لنكرناس ترانسدوسيد في خطوط الخلايا، حققت4،6. إضافة تعديلات إضافية لجرنا، تمكين عوامل النسخي إضافية لربط جرنا، زيادة كفاءة نظام التنشيط الجيني dCas9 إذ7. الأهم من ذلك، اتضح أن يتطلب التنشيط النسخي مقربة (< 200 شركة بريتيش بتروليوم) النسخي ابدأ الجينات الموقع، تمكن من أوبريجوليشن محددة في المناطق الغنية جين7. خلافا لتكنولوجيات بالضربة القاضية كريسبر، أشرطة dCas9 وجرنة بحاجة إلى أن تدمج في الجينوم للسماح للخلايا للاحتفاظ أوفيريكسبريشن على مدى أجيال متعددة. أسلوب واحد لتحقيق هذا الهدف استخدام لينتيفيروسيس لدمج الأشرطة التي تحتوي على dCas9 وجرنة. بعد التكامل، يمكن تحديد التعبير الجيني لنكرنا.
في هذه المقالة، سوف يتجلى بروتوكول أوفيريكسبريشن لنكرنا في نموذج جوركات تي خلية. إجراء خطوة بخطوة ويمكن تكييفها أيضا للخلايا ملتصقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذه المخطوطة على بروتوكول لاستخدام تنشيط كريسبر إلى أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. هذا أسلوب أهمية خاصة عند دراسة الكشف فضله منذ فترة طويلة كمنتج ترانسكريبتوميك هو وحدة وظيفية. بعد أوفيريكسبريشن، الباحث، ثم استخدام هذه الخلايا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند دراسة الشركاء م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
س. ب. معتمد من قبل RO1 DK60729 و P30 DK 41301-26. موانئ دبي معتمد بواسطة كرون والتهاب القولون مؤسسة (معدل) تنمية جائزة مهنة، علاج: مركز بحوث أمراض الجهاز الهضمي (درك) DK41301، والسريرية من جامعة كاليفورنيا ومعهد العلوم متعدية الجنسيات (كتسي) UL1TR0001881. الأساسية علم الفيروسات في جامعة كاليفورنيا بتمويل من مركز أبحاث الإيدز (كفار) منح AI028697 5 ف 30. منح “جامعة كاليفورنيا المتكاملة التكنولوجيات الجزيئية” الأساسية وأيده علاج/P30 DK041301. وأيد هذا العمل أيضا معهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
