Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik
Summary
Wir präsentieren eine einfache zytogenetische Technik mit 4 ‘, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu bestimmen, die Befruchtungsrate und primäre Geschlechtverhältnis der diploide invasive Schädling Tabak Tabaci.
Abstract
Einige Arten von saugenden weiße fliegen sind einige der weltweit schädlichsten terrestrischen Schädlinge wegen der Ernte Schaden, den sie anrichten und Pflanzenviren sie Vektor. Trotz zahlreichen Studien über die Biologie dieser Arten in verschiedenen Umgebungen einem wichtigen Lebensgeschichte Parameter, Nachkommen Geschlechtverhältnisse, wenig Aufmerksamkeit erhalten hat, noch ist wichtig für die Vorhersage der Populationsdynamik. Die primäre Geschlechterverhältnis (Geschlechterverhältnis bei der Eiablage) Tabak Tabaci wurde nie berichtet aber kann durch die Bestimmung der Ei Befruchtungsrate dieses Insekts diploide gefunden werden. Bei dieser Technik wird die Dechorionation von Eiern mit Bleichmittel, eine Reihe von Schritten Fixierung und die Anwendung der allgemeinen DNA fluoreszierende Fleck, DAPI (4 ‘, 6-Diamidino-2-Phenylindole, eine DNA-Bindung Fluoreszenzfarbstoff) an weiblichen und männlichen Vorkerne binden. Hier stellen wir die Technik und ein Beispiel für die Anwendung zu testen, ob ein endosymbiontische Bakterium Rickettsia SP. nr. Bellii, beeinflusst das primäre Geschlechtverhältnis von B. Tabaci. Diese Methode kann helfen, in Bevölkerungsstudien der weiße fliegen oder bei der Bestimmung, wenn Geschlecht Zuweisung mit bestimmte Reize aus der Umwelt vorhanden ist.
Introduction
Das Studium der Geschlecht-Zuweisung oder die relative Investition in männlichen und weiblichen Nachkommen, ist ein Eckpfeiler der Verhaltensökologie1,2,3. Neben seiner Kraft zu Testzwecken adaptive Modelle des Verhaltens kann zu wissen, die Sex-Allocation-Strategie eines Organismus Modelle der Populationsdynamik verbessern. Bei vielen Arten ist Sex Zuordnung von Müttern gesteuert. Um Sex-Zuweisung zu bestimmen, ist es wichtig zu bestimmen, der primäre Sex-Verhältnis oder der Anteil der Frauen bei der Eiablage. Obwohl das Geschlechterverhältnis bei Erwachsenen auftreten können Hinweise auf Geschlecht-Zuweisung vorsehen, kann differentielle Entwicklungsstörungen Mortalität zwischen männlichen und weiblichen Jugendlichen Erwachsenen Sex-Verhältnis häufig erheblich verzerren. Bei einigen Arten der Hautflügler, die Ordnung der Insekten, die Ameisen, Bienen und Wespen, enthält wurde das primäre Geschlechtverhältnis zytogenetische Tests, Färbung der Embryonen genetische DNA anzeigen ermittelt. Weil Hautflügler diploide, eine beginnende männlichen Ei ist haploid und enthält nur die weiblichen Vorkern (n), während beginnende weibliche Eier diploid sind und sowohl männliche als auch weibliche Vorkerne (2n enthalten). Obwohl Aleyrodidae, die Sap-Fütterung Familie True Wanzen (Hemiptera) bekannt als weiße fliegen, auch diploide, hat nicht stattgefunden ein etablierte Assay, der primäre Sex-Verhältnis in dieser Insekten zu finden. Dies ist vielleicht überraschend, da die Intensität der Studie über die paar kosmopolitischen ernsthafte Schädlinge in dieser Familie und die Bedeutung der Geschlechtverhältnisse in wettbewerbsfähige Interaktionen weiße fliegen4,5,6,7 ,8,9,10 und Populationsdynamik im Allgemeinen. In diploide Insekten sind auch Geschlechtverhältnisse ungezwungen Sex Bestimmung Systeme, die Möglichkeit der selektiven Düngung und labile Geschlechtverhältnisse, die mit der Umwelt2variieren. Hier präsentieren wir eine Technik, um festzustellen, das primäre Geschlechtverhältnis des Komplexes Arten der weiße fliegen, zusammen bekannt als die Süßkartoffel Mottenschildläuse, B. Tabaci. Dieser ein Artname umfasst mehr als 28 Arten weltweit11und beinhaltet einige der schädlichsten global invasive Schädlinge12,13. Die Anwendung dieser Technik bestimmen Geschlecht Zuordnungsmuster in B. Tabaci und andere Aleyrodidae ermöglicht eine gründlichere Untersuchung von Variablen, einschließlich Temperatur, Wirtspflanze, endosymbiontische Bakterien oder Pflanzen/Mottenschildläuse Krankheitserreger, die primäre Geschlechtverhältnisse Pflanzensaft und Mottenschildläuse Populationsdynamik beeinflussen können.
Wir sind keine vergleichbaren Ei-beflecken Techniken für B. Tabacinicht bewusst. Das Protokoll ist bequem im Vergleich zu Färbung Methoden für andere Insekteneier14 verwendet, da es einen Übernachtung Fixierung Schritt unterlässt und daher innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden kann. Als ein Beispiel für eine Anwendung, ein endosymbiontische Bakterium, Rickettsien SP. nr. Bellii, ist verbunden mit weiblicher Neigung in unserem Labor Zeilen von B. Tabaci Nahost-Asia Minor 1 (MEAM1)15,16. In B. Tabaci MEAM1 Labor einzeilig (“MAC1,” von der Maricopa Agricultural Center gesammelt), wir testen ob Rickettsia-infizierten (R+) Weibchen befruchten mehr Eier als nicht infizierte Frauen (R–).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist die erste, die Befruchtungsrate oder primäre Geschlechterverhältnis, B. Tabacizu erfassen. Die Herausforderung dieses Protokolls ist, dass es Forscher lernen, wie man die Mottenschildläuse Eier schnell verarbeiten erfordert sicherzustellen, dass nicht mehr als 1 h vergangen, seit die Eier oviposited wurden, bis diese behoben sind. In Vorversuchen waren Eier, die bei 3 h oder mehr Postoviposition befestigt waren zu alt, um die Befruchtung zu beobachten, wie Syngamy eingetreten und mitotisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch eine NSF Grant (DEB-1020460), M.S.H. und ein USDA AFRI-Stipendium (2010-03752), M.S.H. finanziert. Die Autoren danken Brennan Zehr für Färbung Mottenschildläuse Eier mit viel Geschick und Zen. Die Autoren danken Mike Riehle für die Verwendung von seinem fluoreszierenden Mikroskop für die Bildgebung. Die Autoren danken für die Ei-Bilder Suzanne Kelly und Marco Gebiola. Die Autoren danken für die Unterstützung in entscheidenden Momenten während der Experimente Suzanne Kelly und Jimmy Conway.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
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