جهاز تحديد المواقع لوضع الفئران أثناء تسليم siRNA داخل الأنف إلى الجهاز العصبي المركزي
Summary
هنا، نقدم بروتوكول باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس التي تمكن من وضع المناسبة للفئران للإدارة داخل الأنف من الدماغ استهداف الببتيد-siRNA صياغة تمكين إسكات الجينات فعالة في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
وقد برز تسليم المخدرات داخل الأنف (IN) إلى الدماغ كطريقة واعدة لتجاوز حاجز الدم في الدماغ (BBB) لتسليم الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي). الدراسات الحديثة تبين استخدام الببتيد, RVG9R, دمج الحد الأدنى من المجال ملزمة مستقبلات من البروتين السكري فيروس داء الكلب, في الحصول على تسليم سيرنا في الخلايا العصبية في الدماغ. في هذا البروتوكول، يتم تسليم صياغة الببتيد-سيرنا بشكل غير مباشر مع ماصة في اليد المهيمنة، في حين يتم تقييد الماوس التخدير من قبل scruff مع اليد غير المهيمنة في “موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام” لتجنب الصرف في الرئة والمعدة عند الاستنشاق. هذا السيطرة الدقيقة من الفئران يمكن تعلمها ولكن ليس من السهل ويتطلب الممارسة والمهارة لتحقيق فعالية تناول الجهاز العصبي الوطني. وعلاوة على ذلك، فإن العملية طويلة الأمد، وتتطلب حوالي 45 دقيقة لإدارة حجم إجمالي يتراوح بين حوالي 20-30 ميكرولتر من المحلول في أحجام قطرات 1-2 ميكرولتر لكل استنشاق، مع فترات راحة تتراوح بين 3 و4 دقائق بين كل استنشاق. والهدف من هذه الدراسة هو الكشف عن جهاز تحديد المواقع الماوس التي تمكن من وضع المناسبة من الفئران لإدارة كفاءة IN من صياغة الببتيد-سيرنا. يتم دمج ميزات متعددة في تصميم الجهاز، مثل أربعة أو ثمانية كراسي تحديد المواقع مع ارتفاع قابل للتعديل والميل لكبح الفئران التخدير في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام، مما يتيح تصور سهل ة من nares الفئران و المدمج في وسادة التدفئة للحفاظ على درجات حرارة الجسم الفئران خلال الإجراء. الأهم من ذلك، والقدرة على علاج أربعة أو ثمانية فئران في وقت واحد مع المجمعات RVG9R-siRNA بهذه الطريقة تمكن من إجراء دراسات على نطاق زمني أسرع بكثير، لاختبار نهج سيرنا العلاجية. في الختام، يسمح هذا الجهاز لتحديد المواقع مناسبة وخاضعة للرقابة رأس الماوس لتطبيق IN من RVG9R-siRNA والجزيئات العلاجية الأخرى، مثل الجسيمات النانوية أو الأجسام المضادة، لتسليم الجهاز العصبي المركز.
Introduction
يمنع BBB الجزيئات التي تدار بشكل منهجي من > 400-600 دا من دخول الدماغ، مما يشكل تحديا كبيرا لتسليم الجزيئات الحيوية العلاجية للأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي والدماغ1. ويمكن تحقيق التسليم المباشر للمخدرات إلى الدماغ عن طريق الحقن المجسم. ومع ذلك، وهذا يتطلب الخبرة الجراحية ومقيدة للغاية في التسليم إلى المناطق القريبةمن موقع الحقن، مما يجعلها غير مناسبة للاستخدام السريري الروتيني 2. في التسليم إلى الدماغ يمكن أن يؤدي أيضا إلى تسليم الدماغ مباشرة عن طريق تجاوز BBB، مما يسمح للنقل المباشر والسريع لمجموعة متنوعة من المواد إلى الدماغ3،4. ويعتقد أن هذا النقل يحدث عن طريق آليات النقل عن طريق الأعصاب الشمية وثلاثية التوائم التي تربط مرور الأنف إلى الدماغ، والسائل الدماغي الشوكي، والأنظمة اللمفاوية5. كما أن الطريق المباشر من الأنف إلى الدماغ لا ينطوي على الأجهزة الطرفية والأنسجة, فإنه يقلل إلى حد كبير من الآثار الجانبية النظامية ويحسن فعالية. IN Administration هو بديل غير الغازية واعدة على حد سواء الطرق المحلية والنظامية لتسليم الدماغ من العوامل العلاجية، ويمكن أن تمثل نهجا قويا لمكافحة الاضطرابات العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، و سرطان الدماغ، ويجري استكشافها في العديد من التجارب السريرية6و7و8.
العديد من العوامل التجريبية، مثل حجم وطريقة التلقيح، فضلا عن درجة الحموضة في الصياغة، تؤثر بقوة على تسليم المخدرات إلى الجهاز العصبي الوطني عبر مسار الأنف إلى الدماغ9. في الدراسات مع الفئران، ونجاح تسليم المخدرات IN يعتمد بقوة على تحديد المواقع الرأس السليم، وهو أمر بالغ الأهمية لترسب الدماغ كفاءة وتجنب تصريف المخدرات في البيئة الخارجية أو المسالك الهوائية. وتجدر الإشارة إلى أن غالبية دراسات القوارض تستخدم وضع الرأس الخلفي (supine) مع ميل 70 درجة-90 درجة لتسليم المخدرات إلى ظهارة الشم، على الرغم من أن وضع الرأس في 0 درجة قد تفضل الصرف في القصبة الهوائية9. في تسليم الأدوية في الفئران التي هي نتائج مستيقظا في انخفاض ترسب الدماغ بالمقارنة مع أي تطبيق في موقف supine، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم قدرة العلماء على عقد الفئران في الموقف المطلوب لفترات أطول من الزمن. وعلاوة على ذلك، فإن الوضع رأسا على عقب المطلوبة من قبل طريقة قبضة الجلد المستخدمة للفئران مستيقظا يؤدي إلى ترسب المخدرات في الغالب في العصب ثلاثي التوائم ولمبة الشم، فضلا عن الأجهزة الطرفية، مثل الكلى والرئتين، في غضون 30 دقيقة 10. ويبدو أن أنسب وضع للجسم لإيصال العلاجات من خلال الأعصاب الشمية أو ثلاثية التوائم في الحيوانات الكبيرة مثل الرئيسيات غير البشرية في الدراسات السريرية هو وضع الرأس إلى الأسفل وإلى الأمام (أي ما يسمى “الصلاة إلى مكة المكرمة موقف “)11. ومع ذلك، لم يتم دراسة هذا الموقف بشكل جيد في نموذج الماوس، ويستخدم موقف supine على نطاق أوسع في دراسات القوارض.
سابقا, لقد أظهرنا أن RVG9R, الببتيد مصممة على أساس الحد الأدنى من مستقبلات ربط المجال من فيروس داء الكلب, يعرض التروبيسم إلى الخلايا التي تعبر عن وحدات فرعية مستقبلات أستيل النيكوتينمثل الخلايا العصبية والضامة وتوسط في تسليم داخل الخلايا من siRNA من خلال آلية تنطوي على المشاركة مستقبلات ومؤقتة إلغاء توطين غشاء البلازما في موقع تجميع مستقبلات12،13. الأهم من ذلك، الإدارة الوريدية النظامية من المجمعات RVG9R-siRNA تمكن من تسليم عبر الأوعية الدموية من siRNA في الجهاز العصبي الوطني14. ومع ذلك، فإن الطريق النظامي يخفف من كمية siRNA تسليمها إلى الجهاز العصبي الوطني، والبيانات الأخيرة تبين أن إدارة IN من المجمعات RVG9R:siRNA إلى الفئران المتمركزة في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام يثير واسعة الانتشار الجينات المستهدفة بالضربة القاضية في مناطق متعددة من الدماغ15. الأهم من ذلك, وقد تحقق هذا المستوى من الضربة القاضية مع أقل من 13.5 ميكروغرام من siRNA تدار على مدى أربعة جرعة, 2 يوم نظام في حين أن الطريق الرابع يتطلب جرعة أعلى ~ 5 مرات لكل حقن لتحقيق ضربة قاضية مماثلة. القصور الوحيد في نهج IN هو أنه إجراء شاق، يتطلب استخدام كلتا اليدين أثناء إدارة الحل في حين تسيطر باستمرار الفئران بدلا من ذلك في الرأس إلى أسفل وإلى الأمام وفي مواقف استرخاء بين كل استنشاق لفترة طويلة كبيرة من العلاج (إجراء 30-45 دقيقة للاستفادة الفعالة من حجم ~ 20-30 درجة مئوية لكل فأر). باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس المعروضة هنا تمكن من وضع السليم من الفئران مع القليل من الإكراه البدني للالحيوانات والموظفين تنفيذ البروتوكول، فضلا عن علاج مجموعات متعددة من الفئران في غضون فترة معقولة من الزمن، تمكين دراسة متعمقة حول استخدام siRNAs كعلاج لالتهاب الدماغ غرب النيل في الفئران في المراحل المتأخرة من المرض15.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتطوير جهاز لتحديد المواقع الماوس لتحديد المواقع المثلى الفئران لتسليم الأنف إلى الدماغ من العلاجات. وقد تم تجهيز الجهاز مع وظائف مختلفة، وضمان سهولة التعامل في وقت واحد من الحيوانات. كما أنها مجهزة منصات التدفئة للحفاظ على درجات حرارة الجسم الفسيولوجية للالحيوانات أثناء التجريب. يمكن الحفاظ على الفئران التخدير في موقف الرأس إلى أسفل وإلى الأمام عن طريق الكراسي المصممة خصيصا، مع الحد الأدنى من عدم الراحة للالحيوانات. يمكن تعديل ارتفاع كراسي تحديد المواقع بطريقة أفضل لتصور أنف الحيوان أثناء إدارة الأدوية.
في تسليم الدماغ لديها العديد من القيود الجوهرية، بما في ذلك المساحة السطحية الصغيرة من الخياشيم (مما يسمح لأحجام قصوى من 20-30 درجة مئوية لكل إدارة)، تهيج الأنف، تلف ظهارة، وامتصاص محدود عبر ظهارة الأنف18. وقد استخدمت إدارة IN من المخدرات للفئران وضعت في موقف supine لتسليم الدماغ عن طريق إسقاط الأدوية السائلة في nares الحيوانات البديلة عن طريق ماصة أو أنابيب البولي يوريثين (24 G × 19 ملم) متصلة المحاقن ميكرولتر19، 20.على الرغم من أن استخدام أنظمة الأنابيب لإطلاق الأدوية بالقرب من ظهارة الشم هو نهج مناسب محتمل، فإنه يسبب تهيج أو التهاب الأنف عند الإدارة المتكررة. وعلاوة على ذلك ، فإن صغر حجم تجويف الأنف يحد من هذا النهج ، وخاصة في الفئران التي يمكن التغلب عليها عن طريق التكرار ، وكذلك عن طريق تركيبات المخدرات التي تستمر في الغشاء المخاطي للأنف. خيار آخر هو إدارة IN من العلاجات للفئران مستيقظا10. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج إجراءات ماهرة للتعامل مع الحيوانات أثناء التلقيح الداخلي. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسبب الإجهاد الحيواني، وبالتالي، ليست مثالية لنماذج المرض، وخاصة نماذج الأمراض المعدية. وعلاوة على ذلك، قد ينتج التطبيب غير المتسق بسهولة عن تصريف المخدرات في الرئتين أو المعدة بسبب سيطرة الحيوانات غير الكاملة. ويسمح النهج المعروض هنا للعلماء بالتغلب على هذه الحواجز التقنية. رئيس أسفل وإلى الأمام موقف يقلل من إمكانية تسرب المخدرات من الأنف إلى الرئتين أثناء استنشاق, تفضيل التسليم مباشرة وانتقائية siRNA إلى الدماغ. في التسليم باستخدام جهاز تحديد المواقع الماوس لا يتطلب أي تقنية متخصصة للتعامل مع أو الاستيلاء على الحيوانات أثناء التلقيح. يمكن علاج أربعة الحيوانات في وقت واحد لمدة لا تقل عن 30-45 دقيقة. ويمكن توسيع نطاق هذا الإجراء عن طريق إدراج شريط إضافي بأربعة رؤساء، مما يسمح بإدارة سهلة لما يصل إلى ثمانية فئران في نفس الدورة التجريبية. ولذلك، باتباع هذه الطريقة، قد يدفع مشغل واحد إلى توصيل المخدرات إلى أدمغة مجموعات كبيرة من الحيوانات على مدى فترات طويلة من الزمن.
التركيب التشريحي للتجويف الأنفي يؤثر بقوة على الولادة من الأنف إلى الدماغ (كما استعرض هاركوس وآخرون11 وRuigrok ودي لانج21). المساحة السطحية النسبية للتجويف الأنفي في الفئران أكبر 15 مرة من مساحة البشر والمساحة السطحية النسبية للظهارة الشمية أكبر بـ 6 مرات. على الرغم من أن هناك اختلافات كبيرة في تشريح تجويف الأنف في البشر إلى القوارض، هناك ما يقرب من 45 التجارب السريرية الجارية باستخدام نهج IN لعلاج العديد من اضطرابات الدماغ (www.clinicaltrials.gov). تشير الدراسة المعروضة هنا إلى أنه عند استخدام IN تقديم العلاجات، يجب على العلماء النظر في عدة عوامل، مثل وضع الرأس، والنوم، ووكلاء التسليم السليم.
لقد أظهرنا ترسب فعالة ومحددة من siRNA المسمى الفلورسنت إلى الدماغ الماوس. وعلاوة على ذلك، فإن الانخفاض الكبير في التعبير الجيني SOD1 لوحظ بعد تسليم في سرنا أكد الآثار الوظيفية. أظهرنا في السابق باستمرار أن إدارة IN من المجمعات RVG9R-siRNA التي تستهدف فيروس غرب النيل (WNV) RNA يمارس تأثير علاجي قوي على التهاب الدماغ WNV15. وتجدر الإشارة إلى أن تسليم سيرنا من الأنف إلى الدماغ يتطلب ربط الخلايا المستهدفة (RVG) وجزيء مشحون بشكل إيجابي (9R) إلى سيرنا معقدة. في غياب هذه العناصر ، تم مسح الجزيئات من خلال الدائرة الجهازية والأوعية اللمفاوية 48 ح المعالجة اللاحقة (الشكل3A)15. لذلك، في الإعداد التجريبي الموصوفة هنا، قمنا بفحص توطين الببتيد/سيرنا 48 ساعة بعد التلقيح إلى صورة فقط المستويات المحتفظ بها على وجه التحديد في الدماغ. ويمكن تنفيذ هذا النهج بسهولة لتسليم جزيئات أخرى، مثل البروتينات والببتيدات والجسيمات النانوية، أو غيرها من العلاجات، لعلاج عدد من الاضطرابات المتصلة بالدماغ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذا العمل وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية الكورية (HI17C1046) إلى S.K.L.
Materials
| Comercial assays | |||
| iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
| RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
| SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
| Dyes | |||
| Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
| Mouse strain | |||
| Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
| Oligonucleotides and primers | |||
| Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
| siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
| GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
| SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
| Peptides | |||
| RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
| RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
| Software, algorithms and devices | |||
| FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
| Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
| Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
References
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (56), e2968 (2011).
- Khan, A. R., Liu, M., Khan, M. W., Zhai, G. Progress in brain targeting drug delivery system by nasal route. Journal of Controlled Release. 268, 364-389 (2017).
- Meredith, M. E., Salameh, T. S., Banks, W. A. Intranasal delivery of proteins and peptides in the treatment of neurodegenerative diseases. The AAPS Journal. 17, 780-787 (2015).
- Pardeshi, C. V., Belgamwar, V. S. Direct nose to brain drug delivery via integrated nerve pathways bypassing the blood-brain barrier: an excellent platform for brain targeting. Expert Opinion on Drug Delivery. 10, 957-972 (2013).
- Agrawal, M., et al. Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs. Journal of Controlled Release. 281, 139-177 (2018).
- Van Woensel, M., et al. Formulations for intranasal delivery of pharmacological agents to combat brain disease: a new opportunity to tackle GBM. Cancers. 5, 1020-1048 (2013).
- Kulkarni, A. D., et al. Nanotechnology-mediated nose to brain drug delivery for Parkinson’s disease: a mini review. Journal of Drug Targeting. 23, 775-788 (2015).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 1654-1673 (2010).
- Hanson, L. R., Fine, J. M., Svitak, A. L., Faltesek, K. A. Intranasal administration of CNS therapeutics to awake mice. Journal of Visualized Experiments. (74), e4440 (2013).
- Merkus, P., Ebbens, F. A., Muller, B., Fokkens, W. J. Influence of anatomy and head position on intranasal drug deposition. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck. 263, 827-832 (2006).
- Zeller, S., et al. Attachment of cell-binding ligands to arginine-rich cell-penetrating peptides enables cytosolic translocation of complexed siRNA. Chemistry & Biology. 22, 50-62 (2015).
- Kim, J., et al. Silencing CCR2 in macrophages alleviates adipose tissue inflammation and the associated metabolic syndrome in dietary obese mice. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 5, (2016).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39 (2007).
- Beloor, J., et al. Small interfering RNA-mediated control of virus replication in the CNS is therapeutic and enables natural immunity to West Nile virus. Cell Host & Microbe. 23, 549-556 (2018).
- Ullah, I., et al. Trileucine residues in a ligand-CPP-based siRNA delivery platform improve endosomal escape of siRNA. Journal of Drug Targeting. 25, 320-329 (2017).
- Yu, D., Li, G., Lesniak, M. S., Balyasnikova, I. V. Intranasal delivery of therapeutic stem cells to glioblastoma in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (124), e55845 (2017).
- Mittal, D., et al. Insights into direct nose to brain delivery: current status and future perspective. Drug Delivery. 21, 75-86 (2014).
- Renner, D. B., Frey, W. H., Hanson, L. R. Intranasal delivery of siRNA to the olfactory bulbs of mice via the olfactory nerve pathway. Neuroscience Letters. 513, 193-197 (2012).
- Serralheiro, A., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Intranasal administration of carbamazepine to mice: a direct delivery pathway for brain targeting. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 60, 32-39 (2014).
- Ruigrok, M. J., de Lange, E. C. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans. The AAPS Journal. 17, 493-505 (2015).
