פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.
Abstract
תא proteomes מאופיינים לעיתים קרובות באמצעות מבחני אלקטרופורזה, שבו כל המינים של חלבונים בתאי מסומנים בכיתוב הלא ספציפית הפלורסנט, הם הבחינו מאת photodetector בעקבות הפירוד שלהם. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה יכולים לספק זיהוי חלבונים העדינה יכולתה להמחשת מולקולות בודדות פלורסנט. עם זאת, היישום של שיטת הדמיה עוצמה אלקטרופורזה מבחני היא הקשו על ידי חוסר של דרכים כדי לאפיין את ההומוגניות של תיוג פלורסנט של כל מיני חלבונים על פני פרוטאום. . הנה, פיתחנו שיטה כדי להעריך את ההומוגניות תיוג פרוטאום בהתבסס על assay הדמיה קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת. במדידה שלנו באמצעות מדגם הלה תא, היחס של חלבונים עם צבע אחד לפחות, שבו אנחנו כינה ‘תיוג תפוסה’ תוויות (לו), היה נחוש בדעתו טווח של 50% ל 90%, תומך הפוטנציאל הגבוה של היישום מולקולה בודדת הדמיה כדי ניתוח פרוטאום רגיש ומדויק.
Introduction
פרוטאום ניתוח, שמטרתו לכמת את כל סידרת מולקולות חלבון הביע בתא, היא גישה יקר במחקרים עדכניים ביולוגי ורפואי. ניתוח זה נפוץ מסתמך על ספקטרומטר מסה, אשר מזהה מינים חלבון מבוסס על הספקטרום שנוצר באמצעות חלבון יינון1,2,3. שיטה חלופית לניתוח פרוטאום הוא אלקטרופורזה, כולל לזיהוי בג’ל (עמוד), נימי אלקטרופורזה דו-ממדית בג’ל (2D). שיטה זו מתבססת על תיוג פלורסנט שאינם ספציפיים של כל מולקולות חלבון בתאים שנותחה, ואחריו electrophoretic ההפרדה, זיהוי, כימות של כל מיני חלבונים. כדי להשיג חלבון שאינם ספציפיים נדרש תיוג, אסטרטגיה אחת היא להשתמש צבעי פלורסנט ניתן לאגד חלבונים באמצעות אינטראקציות הידרופוביות אלקטרוסטטית, כגון כחול Coomassie ועברית4,5,6 . אסטרטגיית חלופית היא להשתמש תיוג קוולנטיות עם צבעי המכיל N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר או maleimide, אשר באפשרותך לאגוד covalently חלבונים באמצעות משקעים נפוצות כגון אמינים העיקרי תיולים, בהתאמה7, 8.
בינתיים, הרגישות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית הינו אידיאלי עבור ניתוח נמוכה-שפע חלבונים מספר קטן של תאים. מולקולה בודדת פלורסצנטיות הדמיה היא אחת מהשיטות הרגישים ביותר המאפשר זיהוי הפרט צבעי פלורסנט, שכותרתו חלבונים חוץ גופית ו ויוו9,10,11,12, 13,14,15. היישום של שיטת ההדמיה מבוססת-אלקטרופורזה פרוטאום ניתוח צפוי לאפשר מבחני רגישה מאוד ומלאת כמותיים על ידי ספירת חלבונים בודדים עם התווית fluorescently. עם זאת, עדיין לא ברור תיוג עם צבעי פלורסנט היא הומוגנית מספיק על פני כל מולקולות חלבון, ואת ההשפעה הומוגניות זו על ידי חלבונים שונים מינים (איור 1). מדידות פתרון פשוט בצובר יכול לשמש כדי לקבל יחס טוחנת של צבעי פלורסנט כדי הנקרא “צימוד יעילות”8 או ‘תיוג יעילות’, אך מאפיין זה אינו מספק מידע על אחידות בין תיוג מולקולות חלבון.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול assay לחקור את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון בה תא (איור 2)16. שני השלבים המפתח הזה assay הם הדמיה וטיהור חלבונים. בשלב הראשון, כל החלבונים בתאים מסומנות fluorescently, biotinylated, ואז חילוץ בנפרד באמצעות אלקטרופורזה בג’ל ואחריו electroelution. בשלב השני, קרינה פלואורסצנטית המאפיינים של מולקולות חלבון בודדים הדגימות שחולצו מוערכים בהתבסס על הדמיה מולקולה בודדת. מנתוני הזה, לצבוע פרמטרים חשובים לניתוח ספירה, כגון אחוז חלבונים המסומנת אחד לפחות, אשר אנו קוראים תפוסה (LO) תיוג16, המספר הממוצע של צבעי פלורסנט מאוגדים מולקולה של חלבון יחיד (n̄ צבע), ניתן לאפיין. בפרוטוקול, שגרת ממוטב עבור תיוג של פרוטאום הלה תא עם צבע 3 Cyanine (Cy3) המבוסס על אסתר NHS מוצג בתור דוגמה, שניתן יהיה לשנותה באמצעות הליכים אחרים תיוג בהתאם ליעדי המחקר הרצוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול לכמת אחידות תיוג כל מין שכותרתו החלבון בתאים לאחר ההפרדה עם מרחביות-דף (שלב 3). ניתן להחליף את שיטת ההפרדה עם שיטות אחרות כגון כרומטוגרפיה נוזלית או אלקטרופורזה נימי, המאפשרים הפרדה, fractionation של החלבונים עם רזולוציה גבוהה, תוך דרישת ציוד מיוחד23. ניתן להחליף …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Masae אונו, Kazuya נישימורה על ניסיוני סיוע וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי אוטם (JPMJPR15F7), יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות, Grants-in-aid יאנג מדענים (א) (24687022), מאתגר מחקר גישוש (26650055) של מחקר מדעי בתחומים חדשניים (23115005), יפן האגודה קידום המדע, ועל ידי המענקים של קרן המדע טקדה וקרן ההנצחה Mochida רפואי ומחקר התרופות. ס מאשר תמיכה מתוכנית RIKEN הבינלאומי תוכנית לשייך (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
- Berggren, K., et al. Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).
- Butt, R. H., Coorssen, J. R. Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection. Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).
- Nanda, J. S., Lorsch, J. R. Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization. Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
- Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).
- Penna, A., et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).
- Ji, W., et al. Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).
- Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique. Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Grassart, A., et al. Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).
- Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples. Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).
- Ian Freshney, R. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2015).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Sternberg, Biomedical Image Processing. Computer. 16 (1), 22-34 (1983).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. A new criterion for automatic multilevel thresholding. IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).
- Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).
- Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics. EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).
- Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).
- Huang, B., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. i. g. h. -. High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis. Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).
