遠隔実験システム管理: 呼吸器ウイルス診断

1. インストール 注: 2-4 人だけは「レゴのような」研究室ユニットを配置する必要です。最適な 4 個人、展開に使用するが、2 つしか不可能です。 フォーク リフト (図 1 a,B) またはコンテナーを処理するその他の適切な搬送装置を活用します。吊り上げ能力の少なくとも 7 トンのフォーク リフトを使用して、コンテナー24の 2 つのタイプを処理します。 研究室単位をセットアップするには、障害物は適切なレイアウトを損なうように平らな地形で約 90 x 60 平方フィート (27.4 x 18.3 m2) のパッチを選択します。秋の雨の後の水の損失の潜在的な問題を起こすかもしれないので場所の排水を確保するため水はけがよくサイトであることを確認します。根拠を持っている以前平準化、10 kN/dm2の最小強度締固め土壌を使用します。周辺の地域は、その搬送装置からユニットをアンロードするために必要な機器へのアクセスを許可する必要があり、タスクを達成するために必要な支援機器を収容します。 ユニットまたはユニットの「転送モード」でを選択したサイト中央に配置し、、レベルを調整します。各ユニットに 4 つのレベリング ジャッキが装備されており、最大級 6.5% (~ 4 度) を持つサイトに展開できるようにします。コンテナーの最小の標高は 〜 6 インチの床排水、排出管が正しく動作することを確認します。ジャックを 12 インチ以上拡張されません。ジャックの腕にサポート ブラケットを取り付けます。バブル レベラー各下部レールの中心に配置することによって、コンテナーが水平であることを確認します。それは正しく配置されているまでは、ユニットを展開しない! 完全な機能のパネルを開くことによって、ユニットを展開します。まず、ツーピース サポート ポールを探します。その高さはコンテナー単位ほど、サポート ポールを接続します。ポールでは、パネルを開き側のドアを開けると屋根パネルの重量を支えることができます。ロックされたパネルを保つためにピンとして機能する安全クリップがあります。まず、安全クリップを削除し、持ち上げて、穴からカムのロックピンを引きます。コンテナーの下部 (拡張可能な) 側面にあるロック レバーとレバーの後ろにピンを配置します。 このパネルは、ガスを考慮したパネル 1 struts 屋根を上げるし、パネルのドアがロックされている、支柱をリリースする予定します。これはツーピース サポート ポールを用いた屋根 (1 パネル) を高めるためにユーザーになります。一時的にサポートするよう (図 4 a) に屋根パネルの下のサポート ポールの先端を移動します。 サポート突くと屋根のパネルを保持は、安全チェーンを見つける、コンテナーの左上側にあります。2-3 個人の助けを借りて、安全チェーンはまっすぐ、2 パネルの重量を保持で、従事しているまでは、慎重にパネル 2 をドラッグします。 ガス支柱の外面のまわりにそれをラップすることによってラグ マウントにウィンチ ストラップ ベルトを手で接続します。手動で保持し、低下パネルの各側面に、少なくとも 2 人で前の手順を手動で完了できるウインチ ツールがない場合に注意してください。注意: パネルの重量は 260 lb です! 人やパネル 2 とウインチを使用しての方法で項目がないことを確認し、ドリル、パネル (図 4 b) に進みます。パネル 2 を下げて完全にウインチ ・ ウインチにリールを外します。ウインチを取り外し、使用準備のためのコンテナーの反対側に置きます。ユニットの両側、同一ユニットの反対側の上記の同じ手順に従います。 最初の側の完全な展開に (これは現在床) パネルまで到達を持ち上げて両側少なくとも 2 人は、手動でパネル 3 上方場所にドア側 (図 4) の正面の壁と。二人は今後もパネル 3 を押しながら 3 番目の人は、サポート ポールを削除します。注意: 誰がユニット内する必要がありますまたはパネル 3 まで屋根の下で壁の場所で! パネル 3 の中から 2 つのラッチを探し、安全性のストラップを使用して所定の位置にそれらをロックします。確認黒い屋根パネルのゴムのガスケットではユニットの内側の顔を抜いています。これは、雨やユニットに他の水の浸透を防ぐために行う必要があります。 コンテナーの内側からパネル 4 のロックを解除します。一度ロックは、ドアのように開く揺れるように、パネル 4 (図 4) をプッシュします。ロック 2 つの安全ラッチ壁の中。5 パネルのロックを解除し、パネル 4 に対して同じ手順を繰り返します。このパネル同じ内部安全ラッチで固定します。ユニット全体のインテリアをロックされている、一度、床と奥の壁を密封するまでのターン バックルを締め直してください。 コンテナーの両側が安全に展開されているジャックをチェックし、シフトから発生した必要な調整を加えます。毎週レベルをする避難所を確認してください。極端な天候 (雨、風) 後コンテナーのジャックを検査し、それに応じて調整。 接続可能な実験モジュールが使用 (図 5) に計画されている場合は、2 番目のコンテナーを展開します。 水ユニットと電源ユニットに接続します。24に従って手動でディーゼル発電機ブレーカー ボックス ユニットに接続のインストール時に詳細な指示を見つけることができます。注: リモート研究室ユニットが展開されます。ユニットの内部非折り畳み式ボリュームは特定診断テストに必要な装置および実験室の供給の最小値を格納することができます。BSL 3 モジュールの加圧システムのインストール詳細24に記載されている追加の品質管理を必要とします。24 2. 個人保護および基本的な室のワークフローのためのチェックリスト 注: 一般的な安全と検査要件フェーズのいずれかでエラーが全体のテスト プロセスの結果を無効になります。 すべての BSL 2 または BSL-3 安全性要件が考慮できるようにインストールされている研究室単位を入力する準備をして、前に: ドレッシング適切な人員保護具 (PPE) は、手の洗浄、手袋を着用し、任意のワークスペースを除染使用されます。 テスト ラボ BSL 2 と BSL 3 モジュール (組み立てられたグローブ ボックス部屋 – 負圧と PCR ルーム – 肯定的な圧力) で実行中に個人的な保護のための安全要求事項が含まれている表 1のチェックリストに従ってください。 すべての作業スペースや実験室で電源を消毒します。漂白剤にさらされているすべての領域をきれいに 70% のエタノールを使用してワークスペースおよび消耗品を染するソリューション次亜塩素酸ナトリウム (0.5%)、として知られている液体の漂白剤を使用する計画も場合は、漂白剤として有毒ガスを作成するワークスペースの他の化学物質をミックスできます。自分の指定のゴミ箱に漂白剤製品がすべてを破棄します。 研究室単位で作業する前に、その配置とレイアウトに慣れます。グローブ ボックス (GB) 部屋のサンプルを処理するために、厳格な規則が適用されます。GB 部屋が負圧!グローブ ボックスを動作するようにメーカーの説明書を確認してください。複数のソースは、グローブ ボックス操作25の詳細なチュートリアルを提供します。注: この分析の目的は、標本から抽出し、場合は、デオキシリボ核酸 (DNA) やリボ核酸 (RNA) を浄化します。インフルエンザ (INF) – 目標とされたウイルスの病原体の存在有無を検出するリアルタイム RT-PCR 法により抽出した RNA ・ DNA がテストされます。 3. BSL 2 研究所施設で RT-PCR による迅速インフルエンザ ウイルス診断 受信および登録 PPE のチェックリストを申請 (セクション 2 を参照してください)。INF は、BSL 2 練習を必要とするクラス 2 剤です。BSL 2 練習のため適切な PPE が必要です。さらに、安全メガネおよび潜在的な肌の露出を最小限に抑えるかふ袖白衣を着用します。 世界保健機関 (WHO) の推奨事項26, によるとプラスチック製のシャフトを気道からサンプリングの滅菌ダクロンまたはレーヨン綿棒を使用します。注: 木の棒で綿棒またはカルシウム アルギン酸綿棒、コットンがありますいくつかのウイルスを不活性化し、PCR 阻害化合物26,27をテストします。 綿棒サンプルは患者から取られ、としてフィールドまたは診療所から研究所の施設に移送します。パススルー ウィンドウを介して転送サンプルこのウィンドウは、両側から開くことができません。 パススルー ウィンドウで 1 分の漂白剤のサンプルを含むスプレー管 70% エタノールに続いて、研究室単位に入る前に十分な除染を提供するために乾燥拭いてください。水没、次ユニット内ラボ技術者がパススルー ウィンドウを開き、登録する漂白剤コンテナーからサンプルを収集します。通常、サンプルを渡す人とサンプルを抽出する人は同じです。 パススルー ウィンドウを開き、登録するためのサンプル収集します。漂白剤やエタノールで消毒したサンプルを拭きます。70% エタノール溶液に続いてブリーチとパススルー ウィンドウの内部を拭きます。インタラクティブなタブレット ベースのシステムまたはラップトップ内でサンプルを登録します。次の情報とサンプルを識別します。コレクションの日付発症日-患者の年齢と性別・検体の種類 (例:.、鼻綿棒)-一意の識別子-その他関連情報 チューブをラベルにバーコードを使用します。各サンプル チューブと因数に示される 4 つの空のチューブにバーコードを追加します。排気フードにサンプルを移動します。各管にバーコードをスキャンし、タブレット ベースのシステムまたはラップトップ画面に適切なサンプルの識別情報が表示されることを確認します。バーコードに対応していない場合は、耐アルコール マーカーを使用します。これは処理中に切り替えることができますを取得、常にバイアル自体、決してキャップをマーク!登録プロセスを完了します。 サンプル因数 試験管が標識されていると後、に検体をサンプルの因数を見つけ認定クラス 2 安全キャビネットを使用します。1 つの因数は、すぐテストに使えます、他は参照目的または再テストの保持します。 ウイルス輸送培地に鼻綿棒で検体が到着すると 30 s とスクイズの中で綿棒をかき立てるバイアルの側に対してそれ。中小企業処分バイオハザード廃棄物プロトコルから削除します (適切に破棄、オートクレーブまたは 1: 100 塩素溶液にハング)。注: を格納する媒体の最小量は 0.5 mL です。したがって、3 mL のサンプルは 6 の因数 (準標本) に分割できます。冷凍中の余分なボリュームを提供するために、0.5 mL の各サンプルの 1 mL クライオ蓄積管を使用します。 因数を取って、各サンプルの新鮮な滅菌またはディスポーザブルのピペットを使用、クロス汚染を避けるためにバイオハザード廃棄物容器に捨てます。すべてのチューブは密閉し、閉じていることを確認します。 すぐ抽出標本あたり 1 つの因数を活用し、他の因数を冷凍庫に保存 (それは-80 ° C では呼吸器検体) 将来の使用のため。 作業ステーションに移動する前に 70% エタノール溶液に続いてブリーチを使ってすべてのワークスペースの表面と機器を拭き取ります。 抽出・精製 バーコード テスト、移動の質を保証するために PCR のサンプル検体の取り扱い作業駅 (BSL 2 安全キャビネット) 抽出用に指定された領域から因数。この安全キャビネットのサンプルの処理用ピペットの独立したセットがあります。 RNA サンプルの抽出のためのウイルス RNA ミニ キットを使用します。スピン プロトコルによってウイルスの RNA の浄化について製造元の指示に従ってください。抽出に必要なサンプルの数に応じてマスター ミックスを準備します。室温でサンプルおよび換散バッファーのマスター ミックスを維持します。 抽出に必要なサンプルの数を準備します。マイクロ遠心チューブ 1.5 mL をラベル、バーコード番号と一意の識別子。 セット 560 μ L をピペットは、きれいなピペット チップを適用されます。各ラベルのチューブに換散バッファーの 560 μ L を追加します。ヒントを破棄します。きれいなピペット チップを適用します。140 μ L のサンプルを追加します。古い破棄およびきれいなピペット チップを適用します。その他のサンプルを繰り返します。きれいなピペット チップを適用します。ネガティブ コントロール チューブ 140 μ L バッファーに追加します。各チューブをしっかりと閉じます。 パルス渦のサンプル サンプル分注2 15, 繰り返しと制御管の換散バッファーの分注 1。遠心マイクロ – 5 s. 加温室温で 10 分間のサンプルをサンプルします。 インキュベーションの 10 分後再各チューブのフタの内側から任意の滴を削除するチューブを遠心します。エタノール水溶液の 560 μ L をサンプルに追加します。ピペット チップを変更します。サンプルを任意残りや追加を繰り返します。各サンプル チューブをしっかりと閉じるし、渦パルス – 15 s. マイクロ遠心分離機サンプル 5 サンプル s。 スピン列に混合物を適用します。クリーン 2 mL の採血管を取得します。スピン列を追加し、サンプルに合わせて、それらにラベルを付けます。それに応じて、630 μ L のサンプルを一致する列に転送します。 キャップを固定し、遠心に移動します。遠心分離機のサンプルを均等に分散します。換散バッファーを削除する 1 分 6,000 × gで遠心分離機します。作業駅に戻ります。コレクション チューブを交換してください。換散バッファーの残りを追加し、遠心分離のステップを繰り返します。元のサンプル分注チューブを破棄します。 溶出液を破棄し、スピン 2 つのバッファーを洗い流します。バッファー AW1 の 500 μ L を適用します。すべてのサンプルを繰り返します。1 分毎のサンプルと 6,000 × gで遠心するキャップを固定します。2 番目のバッファー AW2 と繰り返し、3 分 20,000 × gで遠心分離します。 最後に溶出バッファーを追加することによって、RNA を溶出します。きれいな 1.5 mL チューブに列を配置、列、室温 1 分と 1 分の 6,000 × gで遠心分離でバッファー アベニュー インキュベートの 60 μ L を追加します。サンプルは、PCR 分析の準備が整いました。 PCR 増幅と検出 PCR のための独立した区域で PCR 増幅を実行します。製造元の指示に従って 1 つのステップの手順の PCR のプロトコルを使用してウイルスのターゲットの PCR 増幅を行います。ウイルス特異的プライマー、プローブ、2 x RT-PCR バッファーと RT-PCR 酵素を使用してマスター ミックスをしたことに注意してください。マスター ミックスを加える板やチューブ追加し、個々 のサンプル (セクション 4.4 を参照) をミックスします。 PCR マシンにプレートを転送し、ウイルス ターゲット増幅条件に従って実行します。サンプルは PCR 機器に読み込まれる実行を完了する約 90 分かかります。 機器の使用後のメンテナンス 表 2によると機器使用後定期的に、定期的なメンテナンスを実行します。 4 BSL 3 研究所施設で RT-PCR による迅速インフルエンザ ウイルス診断 注: BSL 3 条件の下で実験的なプロトコル、同じいては安全対策が何よりも優先されます。BSL 3 研究室に入る前に窓越しに見える透明な確かに負圧がグローブ ボックス単位で確立されていること。それは壁にピンクのボールが表示されてときに、否定的な圧力を確立されていることが明らかになります。 受信および登録 負圧を確立すると、ドアを開き、単位を入力します。すぐに手を洗うし、PPE を続行します。PPE およびワークフロー BSL 3 申請チェックリスト (セクション 2 を参照してください)。 次の順序で PPE に置くに進む: 手袋、ガウン、靴カバー、マスク、フェイスシールド、手袋の 2 番目のペアの下。全身を保護する完全のガウンを着てすることをお勧めします。 マシンをオンにし、安定させるためにグローブ ボックスの圧力を許可します。漂白剤スプレー ソリューションを使用すると、すべてのエリアおよびグローブ ボックス外に使用する用品を消毒します。漂白剤だけコンテナーに漂白剤の廃棄物の処分します。漂白剤の任意の領域をきれいにする使用 70% エタノール溶液が使用されています。 パススルー ウィンドウを介してサンプルを転送します。注: パス ・ スルー ・ ウィンドウにドロップされる前に特に 1 ~ 2 分の次亜塩素酸浴の沈没によってサンプルを含むチューブを消毒、漂白剤溶液サンプルをスプレー、それらを受信する前に、少なくとも 1 分間だけで、パススルーを残すBSL 3 ユニットの内部。外受ける者からサンプルを渡す人、BSL 3 研究室内サンプルを抽出した同じしないでください。 BSL 3 ユニット内部のサンプルを受け取り、登録に進むと手順をラベル付けする前にそれらをきれいに。 対話型のタブレット ベースのシステムや、ノート パソコンでサンプルを登録します。次の情報とサンプルを識別 (3.1.5 のセクションを参照してください)。 チューブをラベルにバーコードを使用します。バーコードに対応していない場合は、耐アルコール マーカーを使用します。注: これは処理中に切り替えることができますを取得自体は、バイアル、キャップ決して常にマーク! サンプル因数 サンプルが登録されているし、チューブがラベル付けされて、一度グローブ ボックス内からサンプルを取得する空気のロックされた皿で認定のグローブ ボックスにサンプルを配置します。戸を閉めて下さい。次にサンプルを取得するためにグローブ ボックスを介して他のドアを開きます。一度に両方のドアを開けないでください。安全上の注意の 2 つの異なる手順の各ドアを開閉します。UV-C 照明をオンにします。 サンプルは、グローブ ボックス内部に安全に移動されている、一度グローブ ボックスでサンプル因数を作成する前に説明した手順に従います。サンプルの 1 つの因数は、すぐテストに使えます、他は参照目的や再テストの保持します。標本はウイルス輸送培地に鼻綿棒の先端に到着します。標本を取るし、各バイアルに 1 つを置きます。30 s とスクイズの中に綿棒の先端をかき混ぜるそれ媒体から削除して、汚染廃棄物のプロトコルを利用したそれを廃棄する前に瓶の側面に (適切に破棄、オートクレーブまたは 1: 100 塩素溶液にハング)。注: を格納する媒体の最小のボリュームはこの目的のための使用 1 mL バイアル 0.5 mL です。したがって、3 mL のサンプルは 6 の因数 (準標本) に分割できます。 各サンプルの新鮮な滅菌や使い捨てピペットを使用し、汚染廃棄物として捨てます。サンプルは、検体が、密閉容器内のサンプルを移動します。保護と瓶を閉じて、グローブ ボックスから削除します。 グローブ ボックス内でバイオハザード廃棄物のバッグを閉じて交差汚染を避けるために新しい廃棄物のバッグを準備します。その後 5 分および 70% エタノール溶液のため漂白剤を適用するグローブ ボックス ワークスペースを消毒します。 即時の分析のための試料につき 1 つの因数を利用し、呼吸器検体は-80 ° c のフリーザーで他を格納します。除染は、テストのため 1 つの因数を保持した後、-80 ° C のフリーザーでストレージ用グローブ ボックスからすべてのサンプルを移動します。 抽出・精製 除染後グローブ ボックスにエリアを処理検体から PCR 解析に必要なバーコード サンプル因数を移動します。 グローブ ボックスで抽出プロシージャの換散のすべての手順を実行します。製造元の指示に従って RNA サンプルの抽出のためのウイルス RNA ミニ キットを使用します。製造元の指示でスピン プロトコルによってウイルスの RNA の浄化のステップバイ ステップの指示に従います。 抽出に必要なサンプルの数を準備します。マイクロ遠心チューブ 1.5 mL をラベル、バーコード番号と一意の識別子。 サンプルとパルス渦の 140 μ L に換散バッファーの 560 μ L を追加します。室温で 10 分間インキュベートします。注: 不活化手順は抽出されています BSL 3 病原体の種類によって異なることが、いくつかのケースでさらに不活性化が必要かもしれません。 散のステップ後しっかりと各サンプルのキャップ シールし、(遠心分離機はグローブ ボックス外に配置) する場合ロック加圧空気の通路に配置。バイオ セーフティ キャビネット プロシージャの残りの部分のために分離のサンプルを転送します。注: BSL-3 病原体や必要なプロトコルによって生物学的安全キャビネットに続いてグローブ ボックス、グローブ ボックスには、RNA の抽出そして浄化のための手順を完了できます。 ワークスペースと、漂白剤を使用して再度グローブ ボックスの供給を染することを確認、すべての領域をきれいにする 70% エタノール溶液公開以前に漂白剤します。 3.3.6 – 3.3.10 洗濯そして RNA の浄化のためのセクションで手順に従います。 抽出、pcr のパススルー ウィンドウにサンプルを転送します。 サンプルを削除して転送したら、セクション 2 によるとグローブ ボックス外検査ワークスペースを消毒します。 PPE を削除する前に、ユニットの空気循環が安全に PPE を削除する開始する前にサイクルをフィルタ リングの適切な数に達するまでを待ちます。削除し、PPE にすべて PPE を処分した直後に無駄にコンテナー、セクション 2 によるとユニットを終了する前に、研究室では石鹸と水で手を洗うに進みます。 PCR 増幅と検出メモ: PCR の拡大は PCR の指定し、パススルー ウィンドウ経由でグローブ ボックスの領域に接続されている別の領域に実行されます。ワークスペースと供給テスト前に染する必要があります。 パススルー ウィンドウから抽出した RNA サンプルを削除します。 ワンステップ PCR のプロトコルを使用してウイルスのターゲットの PCR 増幅を実行します。ウイルス特異的プライマー、プローブ、2 x RT-PCR のバッファー、RT-PCR 酵素を使用してマスター ミックスを準備します。次のコンポーネントに 1.5 mL チューブを使用して、各ターゲットの試金のため: 水、プライマーおよびプローブ、2 x バッファーおよび RT-PCR 酵素です。渦とスピン マスター ミックス。 因数にストリップ管のそれぞれのマスターの組合せ。マスター ミックスを準備されている PCR キット推奨温ストレージに戻る。 各ストリップ管別チップを使用してストリップ管のそれぞれに個々 のサンプルを追加します。サンプル プレートまたは 1 分 1,500 rpm でチューブをスピンします。サンプルは、リアルタイム PCR 装置にロードする準備ができています。 サンプル プレートを PCR 機器に転送し、ウイルス ターゲット増幅条件に応じてマシンを実行します。1 つの実行を完了する約 90 分かかります。 結果の収集と研究室を残して、前に PPE を削除し、セクション 2 によると各ワークステーションおよび次の診断テストのための準備を十分に消毒します。 機器の使用後のメンテナンス 表 2によると機器使用後定期的に、定期的なメンテナンスを実行します。注: 全体的な診断の所要時間は約 4 時間です。抽出時間と時間を設定する PCR のサンプルの数によって異なります、診断テストで 4-5 時間以上がそれに応じて取ることができます。