الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للعزلة من الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من نفس العينة، في محاولة للحد من التباين، وتحسين إمكانية تكرار نتائج، وتيسير التفسيرات.
Abstract
عينة بيولوجية واحدة تحمل عددا كبيرا من المعلومات، والآن ممارسة شائعة للتحقيق الجزيئات عديدة لالتقاط صورة كاملة لمستويات متعددة من تجهيز الجزيئية والتغييرات بين ظروف مختلفة في وقت واحد. ويعرض هذا البروتوكول الأسلوب لعزل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين من نفس العينة من ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس لإزالة الاختلاف وعرض عندما تكون هذه الجزيئات الحيوية المعزولة من replicates من معاملة المثل ولكن في نهاية المطاف عينات مختلفة. يتم استخراج البروتين والأحماض النووية من ديدان أسطوانية باستخدام الأسلوب ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم استخراج حمض جوانيدينيوم، مع هطول الأمطار اللاحقة، والغسيل، وسولوبيليزيشن لكل. علينا إظهار عزلة الناجحة للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي والبروتين من عينة واحدة من ثلاث سلالات من ديدان أسطوانية وخلايا هيلا، مع نتائج أفضل في عزل البروتين في الحيوانات الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يحسن جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم-استخراج البروتين من الديدان الخيطية القرار أكبر من البروتينات، مع تعزيز مستويات لا يمكن اكتشافها وكما لاحظت إيمونوبلوتينج، مقارنة باستخراج ريبا التقليدية للبروتين.
الطريقة المعروضة هنا مفيد عند التحقيق في العينات باستخدام نهج مولتيوميك، على وجه التحديد لاستكشاف البروتين والترنسكربيتوم. تقنيات تقييم مولتيوميكس في وقت واحد جذابة الجزيئية الظواهر الإشارات الأساسية البيولوجية المعقدة ويعتقد أن تحدث في مستويات التكميلية؛ ومع ذلك، أصبح شائعا بصورة متزايدة لنرى أن التغيرات في مستويات مرناً لا تعكس دائماً نفس التغيير في مستويات البروتين وأن وقت جمع ذات الصلة في سياق الأنظمة الإيقاعية. هذا الأسلوب يزيل أي تباين في إينتيرسامبلي عند فحص محتويات مختلفة داخل نفس العينة (إينتراسامبلي).
Introduction
مولتيوميكس، النهج التحليلي الذي يستخدم مزيجاً من اوميكس، مثل الجينوم، البروتين، الترنسكربيتوم، ابيجينومي، ميكروبيومي، أو ليبيدومي، قد أصبحت شعبية متزايدة عند معالجة مجموعات البيانات الكبيرة ل توصيف المرض1، 2. وقد أظهرت الأدلة المتزايدة أن يحد من نهج واحد “ome” يقدم تحليلاً جزيئية ناقصة (استعرضها روتروف وموتسينجير-Reif1). يتم إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات، لا سيما عند أداء شاشات استخدام تقنيات عالية الإنتاجية، ولكن بغية رسم صورة كاملة أو تحديد الأهداف الأكثر صلة بالموضوع، النهج مولتيوميك الأفضل. باستخدام نهج مولتيوميكس، مع ذلك، هناك ملاحظة متكررة من التناقضات بين مرناً والبروتين مستويات3،4،،من56. جدير بالذكر أن مرناً والبروتين المستخدمة في ترانسكريبتوميك جنب ويحلل البروتين مع تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) والسائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، على التوالي، غالباً ما تستمد من المعالجة وكذلك عينات من replicates مختلفة، يحتمل أن الأخذ بالتباين بين نفس الظروف3،4،،من56. هارفالد et al. يؤديها أنيقة الديدان C. ايليجانس المجاعة الوقت بالطبع دراسة مقارنة الترنسكربيتوم والبروتين من البرية من نوع (وزن) لأن له-30 الديدان المسخ التي تفتقر إلى عامل نسخ هامة في طول العمر 7-المذكرة، كانت تحصد في الجيش الملكي النيبالي والبروتين من replicates الشرط نفسه، لذا ليس من نفس العينة. نتائجها تظهر ارتباط منخفضة بين مستويات مرناً ومستويات البروتين في كل نقطة الوقت (r = 0.559 إلى 0.628). في الواقع، شكلت heatmap على أربع مجموعات: الكتلة كان انخفاضا كبيرا في مرناً المستويات إلا قليلاً أو لا انخفاض في مستويات البروتين المقابلة، و “المجموعة الثانية” كان قليلاً أو لا زيادة في مستويات مرناً ولكن زيادة في مستويات البروتين، المجموعة الثالثة زيادة في مرناً المستويات ولكن انخفاضا في مستويات البروتين، و “المجموعة الرابعة” كان زيادة في مستويات مرناً ولكن فقط تغيير دقيق في مستويات البروتين4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إدخال هذا الاختلاف إينتيرسامبلي في الحالات حيث لا يتم جمع العينات من نفس الشرط في نفس الوقت بالضبط. على سبيل المثال، مرناً والبروتينات وينظم دورة الإيقاعية تتقلب اعتماداً على الوقت من اليوم8،9، أو، وبشكل أكثر تحديداً، تعرض C. ايليجانس ل الضوء9؛ قد يتأخر التعبير عن هذه البروتينات الإيقاعية ما يصل إلى 8 ح بعد التعريفي التعبير الجيني10. ومع ذلك، أن انتشار هذه الملاحظة لا يعني بالضرورة أنه من الخطأ؛ وفي الواقع، وهذا يمكن أن تكون مفيدة. البروتين ومرناً يتم في حالة دينامية مستمرة بين تشكيل والتدهور. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما بوستترانسلاتيونالي تعديل البروتينات لزيادة الاستقرار أو للحث على تدهور11. على سبيل المثال، وضعهم أوبيكويتينيشن يمكن أن يؤدي إلى تنشيط أو استهداف بروتوزوم أو يحلول لتدهور12. بالإضافة إلى ذلك، الكشف فضله دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني في مراحل النسخي وبوسترانسكريبشونال13. وهكذا، والسؤال هو كيف للحد من المتغيرات التأكد من أن التناقضات ونلاحظ في هذه الدراسات السلكية حقيقية.
هنا، فإننا نقترح أسلوب يقوم بإزالة المتغير إينتيرسامبلي بالسماح بإجراء تحليلات للجزيئات المختلفة من نفس العينة. والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة لاستمرار عزل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات من عينة واحدة من C. ايليجانس (المشار إليها أيضا كالديدان) في محاولة للحد من التباين، وتحسين إمكانية تكرار نتائج، وتيسير التفسيرات. فوائد إضافية لاستخدام نفس العينة تشمل توفير الوقت والموارد أثناء جمع العينات، تيسير مستعرضة تحليل العينات القيمة ومحدودة، بما في ذلك السلالات التي يصعب على النمو والحفاظ على، واكتساب رؤى في تنظيم التفاضلية للجزيئات استناداً إلى إينتراسامبلي الاختلافات في مستويات البروتين ومرناً.
هذا الأسلوب مناسبة لتقييم التعبير الجيني ومستويات البروتين من عينة واحدة من الديدان، مما يسمح بإجراء تقييم أكثر شمولاً لمستويات متعددة من تجهيز الجزيئية. جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم (جتكب) كاشف14مادة كيميائية تستخدم عادة لعزل الحمض النووي الريبي، يستخدم لاستخراج البروتين والأحماض النووية من الديدان، مع هطول الأمطار اللاحقة، والغسيل، وسولوبيليزيشن لكل. هذا البروتوكول عبارة عن تجميع لمختلف البروتوكولات15،16 مع تعديلات طفيفة، صممت مع تركيز على C. ايليجانس، ولكن نحن أيضا بنجاح معزولة الرنا والبروتين والحمض النووي من بيليه خلايا هيلا بعد نفس الخطوات. على الرغم من عدم اختباره هنا، من المرجح أن تعمل على الأنسجة، وكذلك،من1718هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
هي الأمثل أساليب للعزلة بيوموليكولي، مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، وغالباً دون تداخل التقنية أو تركيبات. هذا الحرمان لا سيما عند عينات من الصعب الحصول على، الذي يمكن أن يؤدي إلى جمع العينات تحت نفس الظروف في أوقات مختلفة. اعتماداً على المسارات الخلوية، replicates المجمعة في أوقات مختلفة قد تولد الاختلاف. هذه المخطوطة ويوفر إجراء للالتفاف على هذه العقبة عن طريق تمكين عزلة المتزامنة وتنقيتها من كل بيوموليكولي من نفس العينة من الديدان، وتقليل الاختلافات الأخذ بتقنيات مختلفة من العزلة، وتوقيت الحصاد عينة، أو الحصاد غير متكافئة. التحكم في هذه المتغيرات ليس فقط يوفر الوقت والموارد، ولكن أيضا يسهل إمكانية تكرار نتائج. هنا، علينا أن نظهر نهج اندماجي يتجنب تعريض الجيش الملكي النيبالي ونوعية البروتين، وأن كان ذلك مع نتائج متغير مع الحمض النووي. يمكن تحسين الاستعدادات كذلك استخدام الحمض النووي إجراءات التنظيف. وقد دللنا النهج باستخدام مواد من خلايا C. ايليجانس والحلة السلكية.
وعرضت الأعمال السابقة استكشاف الترنسكربيتوم والبروتين من الحيوانات N2 WT وطفرات أكل-2 و 1-رسكس التبصر في مسارات مختلفة، بما في ذلك آليات لتمديد عمر4،34،35 ،36. في محاولة للتحقيق في إليه تقييد السعرات الحرارية في تمديد عمر، “وسم النظائر المستقرة” التي مع الأحماض الأمينية في خلية تحليل الثقافة (سيلك) وجد أن 2 أكل الديدان لها دوونريجوليشن العام تخليق البروتين العالمية 36-البيانات المقدمة هنا يتسق مع هذا الاستنتاج، حتى مع زيادة مستويات مرناً الأهداف نفسها التي هي إلى حد كبير. وتهدف إلى تحديد المستجيبة لطول العمر S6K بوساطة مجموعة أخرى، وبالتالي، تقوم شاشة البروتين من الديدان رسكس-1 34. من رناسيق البيانات الموجودة مع الدراسة الحالية، وقد حددنا ثلاثة على الأقل من الجينات التي تؤيد بالبروتينات المحددة من هذه الشاشة؛ تم اكتشاف MRP-1 وهومولوجس نيوروليجين (F07C4.12) وسلطة الائتلاف المؤقتة كما يجري خلطات المعرب عنها في الديدان رسكس-1 مقارنة بوزن N234.
البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب يتسق مع التحقيقات مولتيوميك السابقة. واستخدمت مستويات مرناً تسعة أهداف للتنبؤ بمستويات البروتين في كل عينة. وكان العديد من هذه الأهداف، مستويات البروتين يمكن التنبؤ بها على أساس مستويات مرناً. ومع ذلك، كانت هناك اختلافات ملحوظة بين مستويات البروتين ومرناً. الأهم من ذلك، يسمح بروتوكول المعروضة هنا العلماء ثقة تقييم وتفسير هذه الاختلافات عن طريق إزالة التغير إينتيرسامبلي بجمع مرناً والبروتين من نفس العينة. وعلاوة على ذلك، نحن بالمقارنة مع مستويات مرناً لمستويات البروتين التي تم جمعها من نفس العينة أو التي تم جمعها من عينة مشابهة ولكنها مختلفة المقطوع مع المعهد الملكي. ونحن وأظهرت أن لعدد من الأهداف، كانت هناك مستويات أقل بكثير من البروتين في العينة المستخرجة من المعهد الملكي. دون مراقبة لتباين إينتيرسامبلي، أنه سيكون من المستحيل معرفة إذا كان هذا الاختلاف بسبب تنظيم التفاضلية مرناً والبروتين.
من المهم أن نضع في اعتبارنا أن هناك بروتوكولات الأمثل خصيصا لهذه الجزيئات المختلفة، حتى إذا لم يكن إجراء تحليل مستعرضة والهدف النهائي من هذه التجربة، ثم أنه سيكون وثيقة الصلة باستخدام تلك الأساليب بدلاً من ذلك. استخدام جتكب لعزل الحمض النووي والبروتين يسبب لهم ليصبح أقل قابل للذوبان، تتطلب إعادة تشكيل الحمض النووي في ضعف قاعدة، مثل هيدروكسيد الصوديوم، وسولوبيليزينج البروتين في المخزن مؤقت مع تركيزات عالية من المنظفات مع تدفئة، خطر غير مكتملة سولوبيليزاتيون. بالإضافة إلى ذلك، جتكب يحتوي على ثيوسيانات جوانيدينيوم والفينول الحمضية التي يحللها الإنزيمات مثل البروتياز، ولكن سوف تتحلل البروتينات ببطء مع مرور الوقت ما لم تجمد. سيكون للسلطة التقديرية للباحث أن يقرر إذا كان سوف يكون من المجدي التحايل على هذه القيود.
الأهم من ذلك، عند العمل مع الجيش الملكي النيبالي وتقنية معقمة وحفظ العينة على الجليد إلا إذا ذكر خلاف ذلك واستخدام تطهيرها المتاحة تجارياً كاشف يوصي بالحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي. جدير بالذكر أن عينات أكبر سوف تحتاج جتكب أكثر لتبدأ، فيه كل المذيبات استخراج ستحتاج أيضا إلى الارتقاء. لا يتطلب هذا البروتوكول أي دليل تجانس العينات دودة أو الخلية عند استخدام المبلغ الصحيح من جتكب. في سياق عزل الحمض النووي، العائد تعتمد اعتماداً كبيرا على الكفاءة لاستعادة الطبقة العضوية (الوردي). وأخيراً، لتحسين سولوبيليزيشن البروتينات خلال العزلة، زيادة حجم المخزن المؤقت ريسولوبيليزيشن أو إضافة منظفات أخرى إلى جانب الحزب الديمقراطي الصربي قد يكون ضروريا. والواقع أن البروتينات من نسبة سكان البالغين فقط من الديدان بدلاً من خليط من البالغين واليرقات والبيض أسهل بكثير ريسولوبيليزي.
عموما، استخدام هذا البروتوكول يوفر نهجاً متكاملا للعزلة بيوموليكولي ويسهل تفسير العلاقات المتبادلة، أو عدمه، بين مستويات مرناً والبروتين التي يمكن أن تنشأ عن حصاد الجزيئات الحيوية من مختلف كل على حدة عينات. باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن تساعد العلماء على تحديد الحالات التي لا يرتبط فيها ترجمة مرناً للبروتين ويمكن أن تؤدي إلى تحقيق أعمق من الآليات التنظيمية بوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال تحت ظروف مختلفة بشكل صحيح.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتم تمويل L.R.L. بالمنح من المعاهد الوطنية للصحة/نيا (R00 AG042494 و R01 AG051810)، مؤسسة جلين “جائزة البحوث الطبية” للبحث في الآليات البيولوجية للشيخوخة ومنحة كلية جونيور من “الاتحاد الأمريكي” “بحوث الشيخوخة”. الكتاب يود أن يشكر كومار أنيتا وشي ونغ تشيوان لملاحظاتهم مفيدة في كتابة هذه المخطوطة.
Materials
| 4–15% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Protein Gels | BIORAD | 4568084 | |
| Antibodies: | |||
| CePAS7-s | DHSB- U of Iowa | ||
| CeTAC1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| DLG1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| GRP78 | Novus Bio. | NBp1-06274 | |
| HRP Goat Anti-Mouse | Li-Cor | 926-80010 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit | Li-Cor | 92680011 | |
| HSP60-s | DHSB- U of Iowa | ||
| LMP1-s | DHSB- U of Iowa | ||
| MRP-1 | Abcam | ab24102 | |
| Neuroligin 3 | Abcam | ab172798 | |
| β-actin | Millipore | MAB1501R | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BIORAD | ||
| Chloroform | Fisher | C298-500 | Health hazard, Irritant, Toxic |
| Coomassie Brilliant Blue | ThermoSci | 20279 | |
| DC Protein assay | BIORAD | 500-0116 | |
| Epoch 2 microplate reader | BioTek | ||
| Ethanol (200 proof) | Fisher | 04-355-223 | Flammable, health hazard |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | BSL2 |
| iScript Reverse Transcription Supermix | BIORAD | 1708840 | |
| Hydra microdispenser: Matrix Hydra | Robbins/ThermoFisher | ||
| Isopropanol | Fisher | A516-4 | Flammable, health hazard |
| M9 buffer: 3 g KH2PO4 6 g Na2HPO4 5 g NaCl Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving. After solution cools down, add 1 mL sterile 1 M MgSO4 |
|||
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BIORAD | 161-0737 | |
| NanoDrop One | ThermoSci | ||
| PAGE apparatus | BIORAD | ||
| Ponceau S | Alfa Aesar | J60744 | |
| Primers | IDT | 25 nmole DNA Oligo with Standard Desalting | |
| dlg-1: F (5'-GGTCCTACCA GGCAGTTGAG-3') R (5'-CACGTCCGTT AACCTCTCCC-3') |
|||
| hsp-4: F (5'-AGAGGGCTTT GTCAACCCAG-3') R (5'-TCGTCAGGGT TGATTCCACG-3') |
|||
| hsp-70: F (5'-CGGCATGTGA ACGTGCTAAG-3') R (5'-GAGCAGTTGA GGTCCTTCCC-3') |
|||
| hsp-60: F (5'-ATTGAGCAAT CGACGAGCGA-3') R (5'-CAACACCTCC TCCTGGAACG-3') |
|||
| lmp-1: F (5'-ACAACAACAC CGGACTCACG-3') R (5'-ATCGAGCTCC CACTCTTTGG-3') |
|||
| tac-1: F (5'-AGTGGCAGGC AAAGTTCCTC-3') R (5'-TGAGCACCTT GATCTCGTCG-3') |
|||
| pas-7: F (5'-GTACGCTCAA AAGGCTGTCG-3') R (5'-CTGAATCGGC ATTGGCTCAC-3') |
|||
| mrp-1: F (5'-TTTGCCTTGC GCTTGTTCTG-3') R (5'-AGTTCCAGTG CGGAGCATAC-3') |
|||
| F07C4.12: F (5'-TGCTGAGCAT GAAGGACTGT-3') R (5'-TGGCAATAGC TCCTCCGTTG-3') |
|||
| HK Actin: F (5'-CTACGAACTT CCTGACGGACAAG-3') R (5'-CCGGCGGACT CCATACC-3') |
|||
| HK cyn-1: F (5'-GTGTCACCAT GGAGTTGTTC-3') R (5'-TCCGTAGATT GATTCACCAC-3') |
|||
| HK nhr-23: F (5'-CAGAAACACT GAAGAACGCG-3') R (5'-CGATCTGCAG TGAATAGCTC-3') |
|||
| HK ama-1: F (5'-TGGAACTCTG GAGTCACACC-3') R (5'-CATCCTCCTT CATTGAACGG-3') |
|||
| HK cdc-42: F (5'-CTGCTGGACA GGAAGATTACG-3') R (5'-CTCGGACATT CTCGAATGAAG-3') |
|||
| HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT TCATCACTCAT-3') R (5'-ACACCGTCGA GAAGCTGTAGA-3') |
|||
| LightCycler 96 qPCR machine | Roche | ||
| RIPA buffer: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0.2% SDS 140 mM NaCl 1 tablet of Roche protease inhibitor per 20 ml |
|||
| SsoAdvanced Universal SYBR Supermix | BIORAD | 1725274 | |
| SuperSignal West Femto Max Sens Substrate | ThermoSci | 34095 | |
| Trans-Blot Transfer apparatus | BIORAD | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIORAD | 170-4159 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | Health hazard (skin, eyes) |
| Worm strains: | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| N2 (wild type) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| eat-2 (MAH95) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| rsks-1 (VB633) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- Rotroff, D. M., Motsinger-Reif, A. A. Embracing Integrative Multiomics Approaches. International Journal of Genomics. 2016, 1715985 (2016).
- Chen, R., Snyder, M. Promise of personalized omics to precision medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: System Biology and Medicine. 5 (1), 73-82 (2013).
- Anderson, L., Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis. 18 (3-4), 533-537 (1997).
- Harvald, E. B., et al. Multi-omics Analyses of Starvation Responses Reveal a Central Role for Lipoprotein Metabolism in Acute Starvation Survival in C. elegans. Cell Systems. 5 (1), (2017).
- Griffin, T. J., et al. Complementary profiling of gene expression at the transcriptome and proteome levels in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics. 1 (4), 323-333 (2002).
- Greenbaum, D., Colangelo, C., Williams, K., Gerstein, M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 4 (9), 117 (2003).
- Lapierre, L. R., et al. The TFEB orthologue HLH-30 regulates autophagy and modulates longevity in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 4, 2267 (2013).
- Doherty, C. J., Kay, S. A. Circadian control of global gene expression patterns. Annual Reviews Genetics. 44, 419-444 (2010).
- Goya, M. E., Romanowski, A., Caldart, C. S., Benard, C. Y., Golombek, D. A. Circadian rhythms identified in Caenorhabditis elegans by in vivo long-term monitoring of a bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (48), E7837-E7845 (2016).
- Dalvin, L. A., Fautsch, M. P. Analysis of Circadian Rhythm Gene Expression With Reference to Diurnal Pattern of Intraocular Pressure in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (4), 2657-2663 (2015).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Current Opinion in Structural Biology. 19 (2), 156-163 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26 (4), 399-422 (2016).
- Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Triant, D. A., Whitehead, A. Simultaneous Extraction of High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples. Journal of Heredity. 100 (2), 246-250 (2009).
- Liu, X., Harada, S. RNA Isolation from Mammalian Samples. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
- Kopec, A. M., Rivera, P. D., Lacagnina, M. J., Hanamsagar, R., Bilbo, S. D. Optimized solubilization of TRIzol-precipitated protein permits Western blotting analysis to maximize data available from brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 280, 64-76 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Hoogewijs, D., Houthoofd, K., Matthijssens, F., Vandesompele, J., Vanfleteren, J. R. Selection and validation of a set of reliable reference genes for quantitative sod gene expression analysis in C. elegans. BMC Molecular Biology. 9 (1), 9 (2008).
- Mahmood, T., Yang, P. -. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Peach, M., Marsh, N., MacPhee, D. J., Kurien, B. T., Scofield, R. H. Protein solubilization: Attend to the choice of lysis buffer. Protein Electrophoresis: Methods and Protocols. , 37-47 (2012).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
- Pan, K. Z., et al. Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6 (1), 111-119 (2007).
- Gaudet, P., Livstone, M. S., Lewis, S. E., Thomas, P. D. Phylogenetic-based propagation of functional annotations within the Gene Ontology consortium. Briefings in Bioinformatics. 12 (5), 449-462 (2011).
- Broeks, A., Gerrard, B., Allikmets, R., Dean, M., Plasterk, R. H. Homologues of the human multidrug resistance genes MRP and MDR contribute to heavy metal resistance in the soil nematode Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 15 (22), 6132-6143 (1996).
- Hadwiger, G., Dour, S., Arur, S., Fox, P., Nonet, M. L. A Monoclonal Antibody Toolkit for C. elegans. PLoS One. 5 (4), e10161 (2010).
- Kostich, M., Fire, A., Fambrough, D. M. Identification and molecular-genetic characterization of a LAMP/CD68-like protein from Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Science. 113 (14), 2595 (2000).
- Firestein, B. L., Rongo, C. DLG-1 is a MAGUK similar to SAP97 and is required for adherens junction formation. Molecular Biology of the Cell. 12 (11), 3465-3475 (2001).
- Heschl, M. F., Baillie, D. L. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4), 233-243 (1989).
- Yoneda, T., et al. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (18), 4055 (2004).
- Takahashi, M., Iwasaki, H., Inoue, H., Takahashi, K. Reverse Genetic Analysis of the Caenorhabditis elegans 26S Proteasome Subunits by RNA Interference. Biological Chemistry. 383, 1263 (2002).
- Le Bot, N., Tsai, M. C., Andrews, R. K., Ahringer, J. TAC-1, a regulator of microtubule length in the C. elegans embryo. Current Biology. 13 (17), 1499-1505 (2003).
- McQuary, P. R., et al. C. elegans S6K Mutants Require a Creatine-Kinase-like Effector for Lifespan Extension. Cell Reports. 14 (9), 2059-2067 (2016).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans . Molecular and Cell Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Yuan, Y., et al. Enhanced energy metabolism contributes to the extended life span of calorie-restricted Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 31414-31426 (2012).
