Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

Especies reactivas del oxígeno (ROS) son moléculas reactivas o radicales libres que son subproductos de la respiración aeróbica (revisado en ¹). Estas incluyen el anión superóxido, peróxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y los iones hidroxilo, entre otros. En condiciones fisiológicas normales, ROS son producidos principalmente por las mitocondrias y oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y son desintoxicados rápidamente por varias enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa y glutatión. Una exagerada producción de ROS o un defecto en la capacidad de eliminar ROS puede resultar en estrés oxidativo, por el que especies reactivas de oxígeno promueven el daño de las proteínas, lípidos y ADN llevando a estados patológicos de la enfermedad o la muerte y el estrés celular. Sin embargo, actualmente se aprecia que ROS también pueden actuar como moléculas de señalización (redox signaling), y modificación mediada por ROS de diversas moléculas y productos intermedios de la vía puede influenciar metabolismo celular, proliferación, supervivencia, inflamatoria señalización y envejecimiento². En las células fagocíticas, ROS juega un papel esencial en la prestación de la actividad antimicrobiana durante el llamado “Estallido respiratorio”^1,3,4,5,6. Durante la respuesta de los fagocitos a los estímulos externos, componentes de la NADPH oxidasa complejo (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocan desde el citosol a la membrana phagosomal que contiene la gp91phox y p22phox subunidades, y junto con las acciones de Rac1/2, forman un completamente funcional NADPH oxidasa complejo de la enzima. La oxidasa de NADPH montada entonces utiliza NADPH para reducir el oxígeno a superóxido dentro de la vacuola phagosomal. Aniones superóxido pueden dañar directamente o dismutated en peróxido de hidrógeno. Superóxido y peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con otras moléculas para generar a radicales hidroxilo altamente reactivo. Daño es mediado por la reacción de estos ROS con racimos de hierro-azufre en proteínas o haciendo base oxidación del ADN, en última instancia conduce al limitado metabolismo microbiano o la muerte del microbio⁵. La importancia de la enzima oxidasa de NADPH complejo y ROS producidos durante la explosión respiratoria se ilustra clínicamente en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD)^{7,8,9, 10}. individuos con CGD poseen mutaciones en gp91phox, resultando en una falta de producción de ROS y la susceptibilidad a infecciones recurrentes con bacterias y hongos que normalmente no son una preocupación con los individuos inmunocompetentes. Por lo tanto, si estudiar oxidativo estrés redox señalización y defensa del huésped, pudiendo medir la producción de ROS en tiempo real es un esfuerzo útil.

Múltiples ensayos se han utilizado para la producción de ROS de medida o los resultados de estrés oxidativo^11,12,13. Entre éstos, uno de los más utilizados es la sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH₂-DA)¹⁴. Esta molécula es incoloro y lipofílicas. Difusión de DCFH₂-DA a través de la membrana celular permite que se actuó por esterasas intracelulares, que deacetylates DCFH_2, haciéndola celular impermeable. Las acciones de múltiples tipos de ROS (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico y los radicales Peroxoborato) DCFH₂ oxidan en DCF que es fluorescente (divulgado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) y pueden ser detectados usando un flujo de citómetro equipado con un filtro estándar de fluoresceína (FL1 canal). Superóxido no reacciona fuertemente con DCFH₂ pero puede reaccionar con otra sonda dihydroethidium (DHE) para producir el producto fluorescente 2-hydroxyethidium (así como otros productos de la oxidación de superóxido-independiente fluorescente)¹⁵. Los productos fluorescentes de oxidación DHE pueden detectarse con una longitud de onda de excitación de 518 nm y una longitud de onda de la emisión de 605 nm (FL2 canal). Aunque relativamente fáciles de usar, la utilización de estas sondas para la detección de ROS requiere conocimiento de sus limitaciones y cuidadosa incorporación de tinción procedimientos y controles en el ensayo específico se realiza para poder tener validez experimental resultados y conclusiones. El protocolo siguiente muestra el uso de un kit disponible en el mercado que emplean estos 2 puntas de prueba diseñadas para medir ROS por citometría de flujo. Mancha preparados macrófagos derivados de médula ósea con estas puntas de prueba e inducir la producción de ROS a través de cross-linking FcγR. Presentamos datos representativos obtenidos usando este protocolo y recalcar las precauciones apropiadas que se deben emprender para la experimentación exitosa.