Här presenterar vi ett protokoll för att mäta Shigellacidal aktivitet av antikroppar i serum. -Serum blandas med bakterier och exogena komplement, inkuberas, och reaktionsblandningen är klädd på agarplattor. Livskraftiga bakterier bildar kolonier som räknas, med hjälp av en automatiserad kolonin uppräknare och används för att bestämma bakteriedödande titern.
Serum bakteriedödande analyser (SBAs) mäta den funktionella aktiviteten av antikroppar och har använts i många årtionden. SBAs mäta direkt antikropp dödande aktivitet genom att bedöma möjligheten av antikroppar i serum för att binda till bakterier och aktivera komplement. Denna komplementaktivering resulterar i lys och dödandet av målet bakterier. Dessa analyser är värdefulla eftersom de går utöver kvantifiera antikroppsproduktion för att belysa de biologiska funktioner som dessa antikroppar har, så att forskare att studera den roll som antikroppar kan spela för att förhindra infektion. SBAs har använts för att studera immunsvaret för många mänskliga patogener, men det finns ingen allmänt accepterad metod för Shigella i dagsläget. Historiskt, har SBAs varit mycket arbetsintensiva, som kräver många tidskrävande steg att exakt kvantifiera överlevande bakterier. Det här protokollet beskriver en enkel, robust, och hög genomströmning assay att åtgärder funktionella antikroppar specifika för Shigella i serum in vitro. Den metod som beskrivs här erbjuder många fördelar jämfört med traditionella SBAs, inklusive användning av frysta bakteriell bestånd, 96 assay väl plattor, mikro-kultur system och automatiserade koloni-räkna. Alla dessa ändringar gör denna analys mindre arbetsintensiva och mer hög genomströmning. Detta protokoll är enklare och snabbare att utföra än traditionella SBAs samtidigt som fortfarande använder enkel teknik och lättillgängliga reagenser. Protokollet har tillämpats framgångsrikt i flera oberoende laboratorier och analysen är robust och reproducerbara. Analysen kan användas för att bedöma immunsvar i prekliniska samt kliniska studier. Kvantifiera shigellacidal antikroppsnivåerna var både före och efter antigen exponering (antingen genom immunisering eller infektion) möjliggör en bredare förståelse för hur funktionella antikroppar Svaren genereras och deras bidrag till skyddande immunitet. Utvecklingen av detta standardiserade, välkarakteriserad assay kan kraftigt underlätta Shigella vaccin design.
Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, 3a S. flexneri och S. sonnei, visar epidemiologiska prevalensen globalt. Diarrésjukdomar orsakade av dessa Shigella arterna effekter militära, resenärer1, och är en ledande dödsorsak diarré bland barn under 5 i utvecklingsländerna2år. För närvarande finns det inga licensierade vacciner som skyddar mot Shigella, dock finns det flera kandidat vaccin i olika stadier av utvecklingen. Många av dessa vacciner och andra förebyggande åtgärder håller på att utvecklas, fokuserar på antikroppar produceras mot Shigella lipopolysackarid (LPS). LPS är en attraktiv vaccinkandidat eftersom det är en större ytantigen och naturlig smitta med Shigella inducerar LPS-specifika antikroppar som kan vara skyddande mot återinfektion i ett serotypspecifika sätt. En framgångsrik Shigella vaccin behöver därför förmodligen vara multi-valent och mål 3-4 Shigella serotyp för att framkalla immunitet mot 70-80% av globalt cirkulerande stammar3,4, 5 , 6. Detta kräver att analyser att utvärdera Shigella vaccinkandidater är specifik för flera olika serotyper.
Aktuella immunologiska analyser för att utvärdera vaccinkandidater fokusera på kvantifiera nivåer av antikroppsnivåerna var, men det finns några välkarakteriserad analyser att utvärdera funktionella antikroppar. Undersökning av antikroppar funktionell förmåga är viktigt eftersom patogen specifika antikroppar är ansvariga för att bekämpa infektion genom ett antal funktionella mekanismer inklusive bindande bakterier ytantigener och förhindra vidhäftning till och infektion av epitelceller, inriktning bakterieceller eller opsonization och fagocytos och direkt döda patogener genom bindande och initiera komplement kaskad. Direkta dödandet av bakterier genom antikroppar uppstår när antikroppar binder till ytan komponenter av målet bakterier och initiera komplement kaskad leder till aktivering av många zymogens att i slutändan resultatet i pore formation i bakteriella cell som orsakar lys och bakteriell död. Detta direkt dödande av bakterier av cirkulerande antikroppar och komplement kan vara en avgörande tidiga försvarslinje under infektion.
Individer som är naturligt smittade har antikroppar med shigellacidal aktivitet i deras sera. Dessa Shigella –specifika antikroppar upptäcktes med hjälp av traditionella komplement-medierad dödande analyser 7,8. Detta indikerar att det kan finnas en roll för bakteriedödande antikroppar i skydd mot Shigella. Traditionella bakteriedödande analyserna är enkel i sitt utförande: serum är Värmeinaktiverade (att förstöra endogena komplementaktivitet) och blandas med bakterier av intresse. Exogena komplement läggs till denna blandning på en viss koncentration. Reaktionsblandningen är inkuberas för att möjliggöra bakterie dödande och sedan pläterade bekräfta kolonibildande enheter (CFUs). När CFUs räknas, en 50% döda index (KI) kan beräknas och en SBA titer bestäms. Medan detta förfarande är relativt enkel, dessa analyser kan vara arbetskrävande och tidsödande att utföra och resultatet kan vara mycket varierande. Utöver dessa begränsningar finns för närvarande ingen väl karakteriserade funktionella analyser för Shigella. Därför, vi har framgångsrikt utvecklat och kvalificerade en enkel, högt dataflöde test att mäta Shigella baktericida för tre av de mest kliniskt relevanta stammar9. Det här protokollet beskriver en SBA med ändringar som förbättrar assay effektivitet och reproducerbarhet. Först av dessa ändringar är användningen av frysta bakteriell lagren. Produktionen av engångsbruk lager eliminerar behovet av att kultur färska bakterier för varje analys samtidigt minska assay-till-assay variabilitet. En annan tid och arbete spara fördel av detta protokoll är användningen av ett plattan med 96 brunnar assay format. Detta möjliggör för seriell spädning av prover så att en serie koncentrationer kan testas. Det möjliggör också användning av multikanal för plätering prover på torget petriskålar. När dessa fyrkantiga petriskålar används tillsammans med ett kultur-system som producerar mikro-kolonier, reduceras antalet agarplattor behövs för analysen. Detta, möjliggör i kombination med fritt tillgänglig koloni-inventering programvara, utvecklades ursprungligen för den pneumokocker multiplexade lägre döda assay (MOPA)10, snabb, automatiserad och tillförlitlig kolonin uppräkningen. Alla dessa förbättringar avsevärt minska hands-on assay tid och skapa en hög genomströmning-system som möjliggör flera plattor som ska köras på en gång.
Medan detta protokoll har optimerats för tre av de mest kliniskt relevanta serotyperna av Shigella, SBA beskrivs här kan enkelt appliceras på många andra bakteriella patogener. Förutom detta protokollets potentiella användning med andra bakterier har detta protokoll potential att expandera bortom användande endast serum som utgångsmaterial, vilket kan innefatta analys av antikroppar i andra relevanta provtyper såsom slemhinnor prover, inklusive saliv och fecal prov. Användning av denna analys att undersöka immunologiska svar efter vaccination kan ge bredare inblick i immunsvar som genereras av vaccination leder till rationell design av vacciner, och stöd i förståelsen av hur naturlig immunitet utvecklar.
Protokollet beskrivs här visar en funktionell immun analys för att bedöma shigellacidal aktiviteten av antikroppar i serum. I analysen visat för detta protokoll monoklonala antikroppar specifika för S. flexneri 3a var användas9 tillsammans med mänskliga kontrollsera från ett tidigare Shigella vaccin studie11. Källan till serum testas i denna analys kan varierar kraftigt från prekliniska djur prover till mänskliga kliniska prover, och aktiviteten shigellacidal i serumprovet påverkas av vaccinationer och exponeringar som individen har upplevt. Viss korsreaktivitet kan förväntas mellan närbesläktade serotyper, särskilt S. flexneri 2a och S. flexneri 3a men lite korsreaktivitet har setts i dessa stammar i jämförelse med S. sonnei9. Grunden för SBA fokuserar på aktivering av komplement kaskad av antikropp-antigen bindande. Därför är hanteringen av BRC reagens en av de många kritiska steg som är involverade i genomförandet av detta protokoll. BRC valdes för användning i denna analys på grund av dess konsekvent prestanda och låga nivåer av NSK i andra bakteriedödande analyser12,13,14. Aktiviteten hos BRC är temperaturkänsliga och lämpliga åtgärder måste vidtas för att säkerställa att frysa tö cykler minimeras, att BRC är aliquoted till engångsbruk volymer, och att de BRC alikvoter är tinade snabbt, omedelbart före användning i analysen. Konsekvens av komplementaktivitet påverkar reproducerbarheten för denna analys. En annan avgörande steg som påverkar analysreproducerbarhet är produktion och utspädning av bakteriell bestånd. Det är viktigt att innan du börjar analysen den tillämpliga utspädningen av bakteriell bestånd bestäms, som assay framgång är beroende på konsekvent produktion av kontroller A och B ha CFU räknas i genomsnitt ~ 120 CFU per plats. För att få ställen som är räknebara av programvara, är det också viktigt att den teknik som används för platta bakterier utförs framgångsrikt. Nedfall av bakteriell lösning och vippning av plattan så att ställen kör ~ 2-3 cm är kritisk för att producera kolonier av rätt storlek och rätt distribution för noggrann inventering av NICE programvara. Behärska alla dessa steg kommer att säkerställa att korrekta, konsekventa resultat produceras av detta protokoll
Även när alla kritiska steg utförs finnas väl fortfarande instanser där det är nödvändigt att ändra eller felsöka detta protokoll. Ändringar i detta protokoll att utvärdera andra bakterier kan kräva optimering av övernattning LBA plattan inkubation temperaturen, att säkerställa bildandet av mikro-kolonier. Andra stammar av bakterier eller antikropp källor, utom serum, kan kräva optimering av komplement koncentration. NSK värden och KIs av kontrollserumen bör också övervakas för att säkerställa att analysen fungerar korrekt. NSK bör inte stiger över 70%. KI kontroll sera inte får variera mer än menar ± 2SD. Uppnå lyckad och konsekvent resultat när du använder det här protokollet, kommer det vara nödvändigt att utföra alla steg som beskrivs här med särskild uppmärksamhet på de kritiska steg som beskrivs ovan.
Medan detta protokoll fyller ett viktigt behov i Shigella forskarsamhället, är det inte utan sina begränsningar. Detta protokoll är beroende av biologiskt material och därför kommer alltid att finnas vissa variationer som är svår att kontrollera. Variationer i komplementaktivitet från olika partier och källor kan bidra till variationer i analyser. För att minska detta, är det viktigt att hantera komplement på rätt sätt och testa nya massor av komplement för aktivitet innan köp. Det kan också vara bra att skapa pooler av komplement massor med känd aktivitet har en homogen leverans. Detta protokoll är enkel design och kräver inte någon specialiserad utrustning och automatiserade kolonin enumerating programvara är fritt tillgänglig. Medan denna enkelhet är en fördel, kräver så att detta protokoll att användas i praktiskt taget alla laboratorium, det fortfarande en övernattning inkubation. Senaste analyser har beskrivits som har mycket kortare inkubation kravet, men kräver specialiserade, förberedande reagenser15. En annan begränsning av denna analys är att den i sin nuvarande form endast är kapabel att utreda en enda bakterieart på en gång. I fältet Shigella finns det en önskan att skapa ett multivalenta vaccin, och med immunologiska analyser som kan bedöma patogener i en multiplex sätt är av stort värde. Denna analys skulle kunna ändras i framtiden för att möta detta behov, men i dess nuvarande form, det är en singel-plex assay.
Medan denna analys har vissa begränsningar, har det fortfarande många fördelar jämfört med befintliga eller alternativa metoder. Dessa fördelar omfattar många förbättringar som samverkar till att göra genomförandet av denna metod mycket mindre arbetsintensiva och mer högt dataflöde än traditionella SBAs. Användningen av frysta bakteriell lagren, ett plattan med 96 brunnar assay format, plätering på större fyrkantig petriskålar, färgning av kolonierna som möjliggör fotografering och automatisk koloni-räkna, bidra alla till att minska det material och den tid som behövs för att slutföra detta assay. Denna analys har också fördelar över andra metoder för hög genomströmning eftersom det inte kräver någon specialiserad reagenser eller utrustning. Protokollet beskrivs kan utföras med grundläggande reagenser och fritt tillgänglig programvara, vilket möjliggör dess tillämpning i en laboratoriemiljö.
Alla de fördelar som detta protokoll ger stöder dess användning i många framtida utredningar. Analysen är idealiskt för undersökning av immunsvar efter vaccination eller naturlig infektion. Denna applikation tillåter SBA vara ett värdefullt verktyg i Shigella vaccinforskning och har redan använts för att utvärdera vaccin immunogenicitet hos Shigella bio-conjugate vacciner där det har visat förmåga av dessa vacciner till inducera produktion av funktionella antikroppar16. Detta protokoll har testats av flera laboratorier och har visat att producera tillförlitliga och reproducerbara resultat9. Detta protokoll ger också jämförbara resultat när de samma proverna testas via andra bakteriedödande analyser17. Samstämmigheten i data som genereras av denna analys, och dess förenlighet med andra äldre metoder gör det ett robust verktyg för att exakt bedöma baktericida i serumprov. Analysen kan också enkelt anpassas till utvärdera ytterligare provtyper. Serumet är lätt tillgängliga i vuxen kliniska prövningar, kan det vara svårt att få tillräcklig serum i studier med fokus på spädbarn och små barn. en av eventuella målgrupperna för Shigella vacciner. I dessa prövningar är helblod rutinmässigt insamlade på filterpapper och torkas. Det har varit några preliminära framgångar med denna typ av samplingsformat använda SBA. Utöver helblod är slemhinnor prover (t.ex. saliv, fekal extrakt och urin) också ett mål som är relevanta i Shigella vaccinforskning. För närvarande detta protokoll har utvärderats för tre av de mest kliniskt relevanta serotyperna av Shigella men det kan också anpassas för ytterligare Shigella spp. samt andra bakteriella patogener. Framtida arbete kommer att fokusera på produktionen av en multiplex assay med många av samma egenskaper som den analysmetod som beskrivs i detta protokoll. En multiplex assay möjliggör utvärdering av flera Shigella serotyperna samtidigt ytterligare bevara provvolymer och händer på assay tid. Det finns också arbete pågår för att överföra denna analys laboratorier över hela världen. Dessa globala utvärderingar kommer att generera mer data mot kvalificera analysen på större forskning skala, samtidigt som den ökar antalet mikrobiologi och immunologi laboratorier som har tillgång till denna SBA att utvärdera bakterier och serum prover samlat från olika endemiska platser. Den analysmetod som beskrivs här är enkel och hög genomströmning och har förmågan att förbättra immunologisk bedömning i den Shigella fältet samt bredare program för bedömning av andra bakteriella patogener.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades genom ett bidrag från sökväg till M.H.N. Denna studie genomfördes som en kooperativ forsknings- och utvecklingsavtalet mellan Walter Reed Army Institutet för forskning och University of Alabama i Birmingham.
Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |