Her præsenterer vi en protokol til at måle Shigellacidal aktiviteten af antistoffer i serum. Serum er blandet med bakterier og eksogen supplement, rugede, og reaktionsblandingen er belagt på agar plader. Levedygtige bakterier danner kolonier, som tælles, ved hjælp af en automatiseret koloni optæller, og bruges til at bestemme den baktericide titer.
Serum bakteriedræbende assays (SBAs) måle den funktionelle aktivitet af antistoffer og har været anvendt i mange årtier. SBAs måle direkte antistof drab aktivitet ved at vurdere muligheden for antistoffer i serum til at binde sig til bakterier og aktivere komplement. Denne komplement aktivering resulterer i lysering af og drab af målbakterierne. Disse undersøgelser er værdifulde, fordi de går ud over kvantificere antistof produktion for at belyse de biologiske funktioner, som disse antistoffer har, giver forskerne til at studere den rolle, som antistoffer kan spille i forebyggelse af infektion. SBAs har været brugt til at studere immunrespons for mange menneskelige patogener, men der er ikke bredt accepteret metode for Shigella på nuværende tidspunkt. Historisk set, har SBAs været meget arbejdskrævende, der kræver mange tidskrævende trin til nøjagtigt kvantificere overlevende bakterier. Denne protokol beskriver en enkel, robust, og høj overførselshastighed assay at foranstaltninger funktionelle antistoffer specifikke for Shigella i serum in vitro. Metoden beskrevet her tilbyder mange fordele frem for traditionelle SBAs, herunder brugen af frosne bakteriel lagrene, 96 assay godt plader, en mikro-kultur system og automatiseret koloni-optælling. Alle disse ændringer gør dette assay mindre arbejdskrævende og mere høj overførselshastighed. Denne protokol er enklere og hurtigere at udføre end traditionelle SBAs mens du stadig bruger enkle teknologier og let tilgængelige reagenser. Protokollen har været anvendt med succes i flere uafhængige laboratorier og analysen er robust og reproducerbar. Analysen kan bruges til at vurdere immunrespons i prækliniske samt kliniske undersøgelser. Kvantificere shigellacidal antistof titers både før og efter antigen eksponering (enten ved vaccination eller infektion) giver mulighed for en bredere forståelse af hvordan funktionelle antistof svar er genereret og deres bidrag til beskyttende immunitet. Udviklingen af det standardiserede, godt karakteriseret assay kan høj grad lette Shigella vaccine design.
Shigella serotyper, Shigella flexneri 2a, S. flexneri 3a og S. sonnei, påvise epidemiologiske forekomst globalt. Diarré sygdom forårsaget af disse Shigella arter virkninger militære, rejsende1, og er en førende årsag til diarré dødsfald blandt børn under 5 i udviklingslandene2. Der er i øjeblikket ingen licens vacciner beskytter mod Shigella, men der er flere kandidat vacciner på forskellige udviklingsstadier. Mange af disse vacciner og andre forebyggende foranstaltninger i øjeblikket i udvikling, fokusere på antistoffer produceres af Shigella LPS (LPS). LP’ER er en attraktiv vaccine kandidat, fordi det er en større overflade antigen og naturlig infektion med Shigella inducerer LPS-specifikke antistoffer, der kan være beskyttende mod ny infektion i en serotype-specifikke måde. Derfor, en vellykket Shigella vaccine vil sandsynligvis nødt til at være multi-Valente og mål 3-4 Shigella serotyperne for at fremkalde immunitet mod 70-80% af globalt cirkulerende stammer3,4, 5 , 6. det kræver at assays til at evaluere Shigella vaccine kandidater være specifik for flere forskellige serotyper.
Nuværende immunologiske assays til evaluering vaccine kandidater fokusere på kvantificere niveauer af antistof titers, men der er par godt karakteriseret assays til at evaluere funktionelle antistoffer. Undersøgelse af antistof funktionsevne er vigtigt fordi patogen specifikke antistoffer er ansvarlige for bekæmpelse af infektion gennem en række funktionelle mekanismer, herunder bindende bakterier overflade antigener, og at forhindre adhæsion til og infektion af epitelceller, målretning bakterieceller eller opsonization og fagocytose, og direkte dræbe patogener af bindende og indlede supplement cascade. Den direkte drab af bakterier af antistoffer opstår når antistoffer binder sig til overfladen komponenter af målbakterierne og indlede supplement cascade fører til aktivering af mange zymogens at i sidste ende resultere i pore dannelse i bakterielle celle forårsager lysis og bakteriel død. Denne direkte drab af bakterier af cirkulerende antistoffer og supplement kan være en afgørende tidlig linje i forsvaret under infektion.
Personer, der er naturligt inficeret have antistoffer med shigellacidal aktivitet i deres sera. Disse Shigella –specifikke antistoffer blev fundet ved hjælp af traditionelle komplement-medieret drab-undersøgelser, 7,8. Dette indikerer, at der kan være en rolle for bakteriedræbende antistoffer i beskyttelse mod Shigella. Traditionelle bakteriedræbende assays er enkle i deres udførelse: serum er varme-inaktiverede (at ødelægge endogene supplement aktivitet) og blandet med bakterier af interesse. Eksogene supplement er tilføjet til denne blanding på en bestemt koncentration. Reaktionsblandingen er udruget for at give mulighed for bakteriel drab og derefter belagt for at bekræfte kolonidannende enheder (CFUs). Når CFUs tælles, en 50% dræbe indeks (KI) kan beregnes og en SBA titer bestemt. Mens denne procedure er forholdsvis enkel, disse assays kan være arbejdskrævende og tidskrævende at udføre og resultaterne kan være meget varierende. Ud over disse begrænsninger, ingen godt karakteriseret funktionelle assays i øjeblikket eksisterer Shigella. Derfor har vi med succes udviklet og kvalificeret en enkel, høj overførselshastighed assay at måle Shigella bakteriedræbende aktivitet for tre af de mest klinisk relevante stammer9. Denne protokol beskriver en SBA med ændringer, der forbedrer assay effektivitet og reproducerbarhed. Først af disse ændringer er brugen af frosne bakteriel bestande. Produktionen af engangsbrug bestande eliminerer behovet for kultur frisk bakterier for hvert assay samtidig reducere analysen til assay variation. En anden tid og arbejdskraft gemme fordel af denne protokol er brugen af en 96-brønd plade assay format. Dette giver mulighed for seriel fortynding af prøver, således at en række koncentrationer kan testes. Det giver også mulighed for brug af multikanals pipetter til plating prøver på firkantet petriskåle. Når disse firkantede petriskåle bruges sammen med en kultur-system, der producerer mikro-kolonier, reduceres antallet af agar plader kræves for analysen. Dette, i kombination med frit tilgængelige koloni-optælling software, oprindeligt udviklet til den pneumokok multiplex opsonophagocytic drab assay (MOPA)10, giver mulighed for hurtig, automatiseret og pålidelige koloni-optællingen. Alle disse forbedringer reducere hands-on assay tid og skabe en høj overførselshastighed system giver mulighed for flere plader skal køres på en gang.
Mens denne protokol er blevet optimeret til tre af de mest klinisk relevante serotyper af Shigella, SBA beskrevet her kan nemt anvendes til mange andre bakterielle patogener. Ud over denne protokol potentielle anvendelse med andre bakterier har denne protokol potentiale til at ekspandere ud ved hjælp af kun serum som råvare, som kunne omfatte en analyse af antistoffer i andre relevante prøve typer såsom slimhinde prøver, herunder spyt og fækal prøver. Brugen af denne analyse at undersøge immunologiske reaktioner efter vaccination kan give bredere indsigt i immunrespons genereret af vaccination fører til den rationelt design af vacciner, og støtten i forståelse af hvordan naturlige immunitet udvikler.
Protokollen beskrevet her viser en funktionel immun assay for at vurdere shigellacidal aktiviteten af antistoffer i serum. I analysen viste for denne protokol monoklonale antistoffer specifikke for S. flexneri 3a blev brugt9 sammen med kontrol menneskelige sera fra en tidligere Shigella studere vaccine11. Kilden til serum testet i dette assay kan varierer meget fra prækliniske animalske prøver til humane kliniske prøver, og shigellacidal aktivitet i serumprøven vil blive påvirket af vaccinationer og engagementer, at enkelt har oplevet. Nogle krydsreaktivitet kan forventes mellem nærtbeslægtede serotyper, især S. flexneri 2a og S. flexneri 3a men lille krydsreaktivitet er blevet set i disse stammer i forhold til S. sonnei9. Grundlag af SBA fokuserer på aktivering af komplement kaskade af antigen-antistof bindende. Derfor, håndtering af BRC reagens er en af de mange kritiske trin involveret i gennemførelsen af denne protokol. BRC blev udvalgt til brug i denne analyse på grund af sin ensartet ydelse og lave niveauer af NSK andre bakteriedræbende assays12,13,14. Aktiviteten af BRC er temperatur følsom og skal træffes passende foranstaltninger til at sikre, Frys thaw cycles er minimeret, at BRC er aliquoted til engangsbrug diskenheder, og at BRC delprøver er optøet hurtigt, umiddelbart før brug i analysen. Sammenhængen i supplement aktivitet vil påvirke reproducerbarhed af denne analyse. En anden afgørende skridt, der påvirker assay reproducerbarhed er produktion og fortynding af bakteriel bestande. Det er vigtigt, at før du begynder analysen den passende fortynding af bakteriel bestande bestemmes, som analysen succes er afhængig af den ensartet produktion af kontrol A og B har CFU tæller gennemsnit ~ 120 CFU pr. spot. For at få steder, der er tællelig af softwaren, er det også bydende nødvendigt, at teknik, der anvendes til plade bakterier er udført. Deposition af bakteriel løsning og vippe af pladen, således at steder køre ~ 2-3 cm er kritisk for at producere kolonier af den lige størrelse og korrekt fordeling til præcis optælling af den hyggelig programmel. Mastering alle disse trin sikrer, at nøjagtige og ensartede resultater er produceret af denne protokol
Selv når alle kritiske trin udføres kan godt der stadig være tilfælde hvor det er nødvendigt at ændre eller foretage fejlfinding af denne protokol. Ændringer af denne protokol til at evaluere andre bakterier kan kræve optimering af overnight LBA plade inkubation temperaturen, for dannelsen af mikro-kolonier. Andre stammer af bakterier eller antistof kilder, bortset fra serum, kan kræve optimering af supplement koncentration. NSK værdier og KIs af kontrol sera bør også overvåges for at sikre, at analysen arbejder korrekt. NSK bør ikke stige over 70%. KI kontrol sera ikke bør variere betyde mere end ± 2SD. For at opnå succesfulde og konsekvente resultater, når du bruger denne protokol, vil det være nødvendigt at udføre alle trinene som beskrevet her med særlig vægt på de kritiske trinene ovenfor.
Mens denne protokol udfylder en vigtig behov i forskerkredse Shigella , er det ikke uden sine begrænsninger. Denne protokol er baseret på biologiske materialer og vil derfor altid være nogle variation, der er svære at styre. Variationer i supplement aktivitet fra forskellige partier og kilder kan bidrage til variation i assays. For at afbøde dette, er det vigtigt at håndtere supplement korrekt og teste nye masser af supplement til aktivitet før køb. Det kan også være nyttigt at oprette emnepuljer supplement masser med kendt aktivitet at have en ensartet forsyning. Denne protokol er simpel af design og kræver ikke nogen specialiseret udstyr og automatiseret kolonien optælling af software er frit tilgængelig. Mens denne enkelthed er en fordel, kræver at lade denne protokol anvendes i stort set ethvert laboratorium, det stadig en natten inkubation. Seneste assays er blevet beskrevet, har meget kortere inkubation krav, men kræver specialiseret, forberedende reagenser15. En anden begrænsning i denne analyse er, at i sin nuværende form kun er i stand til at undersøge en enkelt bakteriearter på én gang. I feltet Shigella er der et ønske om at skabe en multivalent vaccine, og har immunologiske assays, der kan vurdere patogener i en multiplex måde er af stor værdi. Denne analyse kan ændres i fremtiden for at imødekomme dette behov, men i sin nuværende form, det er en single-plex assay.
Mens denne analyse har visse begrænsninger, har det stadig mange fordele frem for eksisterende eller alternative metoder. Disse fordele omfatter mange forbedringer, der kombineres for at gøre udførelsen af denne metode meget mindre arbejdskrævende og mere høj overførselshastighed end traditionelle SBAs. Brugen af frosne bakteriel lagrene, en 96-brønd plade assay format, plating på større firkantet petriskåle, farvning af kolonierne, der giver mulighed for at fotografere og automatisk koloni-optælling, bidrage alle til at reducere de materialer og tid til at fuldføre dette assay. Denne analyse har også fordele frem for andre metoder, høj overførselshastighed, fordi det ikke kræver nogen specialiserede reagenser eller udstyr. Protokollen beskrev kan udføres med grundlæggende reagenser og frit tilgængelig software, så for dens anvendelse i et laboratorium indstilling.
Alle de fordele, denne protokol giver støtter dets anvendelse i mange fremtidige undersøgelser. Analysen er særdeles velegnet til undersøgelse af immunrespons efter vaccination eller naturlig infektion. Dette program giver mulighed for SBA at være et værdifuldt redskab i Shigella vaccine forskning og er allerede blevet anvendt til at evaluere vaccine immunogenicitet i Shigella bio-konjugat vacciner hvor det har vist evne af disse vacciner til medføre produktion af funktionel antistoffer16. Denne protokol er blevet grundigt testet af flere laboratorier og har vist sig at producere pålidelige, reproducerbare resultater9. Denne protokol producerer også sammenlignelige resultater, når de samme prøver er testet ved hjælp af andre bakteriedræbende assays17. Sammenhængen i data genereret af denne analyse, og kompatibiliteten med andre ældre metoder gør det en robust værktøj til præcist vurdere bakteriedræbende aktivitet i serumprøver. Analysen kan også let tilpasses evaluere ekstra prøve typer. Mens serum er let tilgængelige i voksen kliniske forsøg, kan det være svært at få tilstrækkelig serum i forsøg med fokus på spædbørn og små børn; en af de endelige målpopulationer for Shigella vacciner. I disse forsøg, fuldblod rutinemæssigt indsamles på filtrerpapir og tørret. Der har været nogle indledende succes med denne type prøve format ved hjælp af SBA. Ud over fuldblod er slimhinde prøver (f.eks. spyt, fækal ekstrakter og urin) også et mål, der er relevante i Shigella vaccine forskning. I øjeblikket, denne protokol er blevet evalueret for tre af de mest klinisk relevante serotyper af Shigella , men det kan også tilpasses yderligere Shigella spp. samt andre bakterielle patogener. Fremtidige arbejde vil fokusere på produktionen af en multiplex assay med mange af de samme egenskaber som analysen beskrives af denne protokol. En multiplex assay vil give mulighed for evaluering af flere Shigella serotyper samtidigt, yderligere bevare prøve diskenheder og hænder på assay tid. Der er også arbejde undervejs at overføre dette assay til laboratorier over hele kloden. Disse globale evalueringer vil generere flere data mod kvalificerende assay forskning ligestillingsudviklingen, samtidig med at det stigende antal Mikrobiologi og Immunologi laboratorier, der har adgang til denne SBA at evaluere bakterier og serum prøver indsamlet fra forskellige endemiske steder. Analysen beskrevet her er enkel og høj overførselshastighed og har mulighed for at forbedre immunologiske vurdering i Shigella felt, samt bredere applikationer til vurdering af andre bakterielle patogener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra stien til M.H.N. Denne undersøgelse blev gennemført som et kooperativ forskning og udviklingsaftale mellem Walter Reed Army Institute of Research og University of Alabama i Birmingham.
Gelatin | Sigma | G9391 | Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture |
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) | Sigma | T8877 | ≥98.0% (HPLC) |
Sodium azide (NaN3) | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
Baby Rabbit Complement | PelFreez | 31061-3 | 3-4 week old |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14065-56 | Without Phenol Red |
LB Agar (Lennox) | Sigma | L2897 | Powder microbial growth medium |
Bacto Agar | BD | 214010 | Powdered, (C12H18O9)n |
Glycerol | Sigma | G5516 | For molecular biology, ≥99% |
LB Broth (Lennox) | Sigma | L3022 | Powder microbial growth medium |
Square Petri Dish | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm x 120 mm |
Assay Plate | Costar | 3799 | 96 well u-bottom plate with lid |
NICE Software | University of Alabama at Birmingham | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |