Xylem-Wasserverteilung in Holzpflanzen visualisiert mit einem Kryo-Scanning-Elektronenmikroskop

Die Verfügbarkeit von Wasserressourcen (d. h. Niederschlag, Bodenwassergehalt) bestimmt streng die Sterblichkeit und geografische Verteilung der Pflanzenarten, da sie Wasser aus dem Boden aufnehmen und zur photosynthetischen Produktion zu den Blättern transportieren müssen. Die Anlagen müssen ihr Wassertransportsystem unter schwankender Wasserversorgung aufrechterhalten. Insbesondere holzige Pflanzen erzeugen hohe Spannungen in ihren Leitungen entlang der Transpirationsströme, da sie in einigen Fällen ihre Krone mehr als 100 m über dem Boden halten müssen. Um Wassersäulen unter einem derart hohen Unterdruck zu erhalten, bestehen Xylemschläuche aus einem Kontinuum von Röhrenzellen mit starren und hydrophob-lignifizierten Zellwänden¹. Die Anfälligkeit für xylem Dysfunktion von Xylem-Schläuchen in jeder Art ist eine gute Determinante des Artenüberlebens unter schwankender Wasserversorgung². Darüber hinaus ist die Untersuchung des Wasserstatus von Xylem-Schläuchen wichtig für die Beurteilung des Gesundheitszustandes einzelner Bäume, die abiotischen oder biotischen Belastungen ausgesetzt sind. Die Messung des Saftdurchflusses oder des Wasserpotenzials kann aufgrund der integrierten hydraulischen Funktion von Xylem-Leitungen Schätzungen des Wasserzustands einer holzigen Pflanze liefern. Darüber hinaus kann die Visualisierung der Wasserverteilung in Xylemzellen den Zustand einzelner Komponenten des Xylem-Hydrauliksystems klären.

Es gibt mehrere Techniken zur Visualisierung des Wasserzustands von Xylem-Leitungen³. Die klassischen und nützlichen Methoden zur Beobachtung von Wasserwegen in holzigem Gewebe beinhalten das Färben der Wassersäule, indem die Enden geschnittener Äste in einen Farbstoff eingetaucht werden oder indem ein Farbstoff in stehende Baumstämme injiziert wird⁴. Weiche Röntgenfotografie ermöglicht auch die Visualisierung der Wasserverteilung von geschnittenen Holzscheiben aufgrund der differenziellen Röntgenabsorptionsintensität der Feuchtigkeit in Xylem^5,6. Diese Methoden liefern jedoch nur Spuren der Wasserbewegung oder zeigen makroskopische Wasserverteilungen. Kürzlich wurden zerstörungsfreie Beobachtungstechniken, wie z. B. mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (CT)^7,8,9,10und Magnetresonanztomographie (MRT)^{11, 12}wurden deutlich verbessert, um die Beobachtung von Wasser in Xylem-Leitungen in intakten Setzlingen zu ermöglichen. Diese zerstörungsfreien Methoden haben große Vorteile, da wir den Wasserzustand des Xylems ohne künstliche Schnitteffekte beobachten können und wir die Wasserströmungsdynamik durch sequenzielle Bildgebung oder die Einführung eines Kontrastmittels¹⁰verfolgen können. Wir müssen jedoch eine kundenspezifische MRT für die Pflanzenbildgebung oder eine spezielle Einrichtung für Synchrotron-basiertes CT verwenden, um die Bilder zu erhalten, die den Zellpegelwassergehalt identifizieren können. Obwohl das Synchrotron-basierte CT-System feine Bilder mit hoher räumlicher Auflösung erhalten konnte, was mit der Lichtmikroskopie^7,8,9vergleichbar ist, können lebende Zellen durch die Strahlung von hochenergetischer Röntgenstrahlung^13,14. Der Einsatz eines Rasterelektronenmikroskops, in dem Kryo-Einheiten installiert sind (Cryo-SEM), ist eine sehr nützliche Methode, um das Wasser in Xylem auf zellulärer Ebene präzise zu lokalisieren, obwohl dies eine zerstörerische Entnahme der Probe zur Beobachtung erfordert. Zur Fixierung des Wassers in Xylemschläuchen wird ein Teil der Stiele (d. h. Zweige, Zweige oder Stiele) vor Ort durch flüssigen Stickstoff eingefroren (LN₂). Beobachtungen der Oberfläche von getrimmten, gefrorenen Proben durch kryo-SEM liefern hochvergrößerte Bilder der Xylemstruktur, von denen aus wir das Wasser in Xylemschläuchen als Eis identifizieren können. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass eine sequenzielle Beobachtung der Wasserbeweglichkeit innerhalb derselben Probe unmöglich ist. Die Anwendung von CT oder MRT zur sequentiellen Beobachtung von Bäumen, die in einem Feld leben, ist jedoch äußerst anspruchsvoll, da diese Instrumente nicht tragbar sind. Im Gegensatz dazu hat cryo-SEM das Potenzial, diese Technik auf großen Bäumen in Feldexperimenten zu verwenden, um den Wassergehalt nicht nur auf zellulärer Ebene, sondern auch auf einer feineren Strukturebene, z.B. Wasser in intervaskulären Gruben¹⁵, Wasser in interzelluläre Leerzeichen¹⁶oder Blasen in Derwassersäule¹⁷.

Viele Studien zur Beobachtung von Xylemwasser durch kryo-SEM wurden 5 ^{,12,18,19,20,21,23}berichtet. Utsumi et al. (1996) erstellten zunächst das Protokoll zur Beobachtung von Xylem in situ durch Einfrieren-Fixierung eines lebenden Stammes über das Befüllen von LN₂ in einen Behälter, der auf den Stamm eingestellt ist²¹. Die Temperatur der Probe wurde während der Probenentnahme und während der Kryo-SEM-Vorbereitung unter -20 °C gehalten, um ein Schmelzen des Eises in Xylem-Leitungen zu vermeiden. Diese Methode wurde verwendet, um das Wasser in Xylem zu beobachten, um die Wasserverteilung unter wechselndem Wasserregime^{11,12,24,25,26}zu klären. ^27,28, die saisonale Variation der Wasserverteilung^21,29,30, die Wirkung von Frost-Tau-Zyklen^{17,31, 32}, die Verteilung von Wasser in nassem Holz⁵, Veränderungen in der Wasserverteilung während des Übergangs von Splintholz zu Kernholz²⁰, saisonale Zeit Verlauf der cambial Aktivität und Differenzierung der Gefäße³³, kavitation induziert durch bestimmte biotische Spannungen^23,34. Hydraulische Leitfähigkeit und Leitungsanfälligkeit gegenüber Kavitation wurden ebenfalls mit kryo-SEM^35,36überprüft. Cryo-SEM mit energiedispersiver Röntgenspektrometrie (EDX oder EDS) wurde verwendet, um die Elementverteilung über die Oberfläche einer Wasseraufnahme zu untersuchen³⁷.

Die Frostfixierung eines lebenden Stammes, der Leitungen unter hoher hydraulischer Spannung enthält, verursacht manchmal künstliche Kavitationen, die von cryo-SEM als gebrochene Eiskristalle im Lumen der Leitungen^38,39beobachtet werden. Insbesondere Breitlaubarten mit längeren und breiteren Schläuchen sind anfällig für spannungsinduzierte Artefakte, wie z. B. Kavitation durch Probenschneiden, auch wenn sie unter Wasser 3^,40durchgeführt werden. Kavitationsartefakte werden nach der Probenahme eines sich aufstellenden Baumes (d. h. Probenahme während des Tages) oder unter schweren Dürrebedingungen auffällig und können zu einer Überschätzung des Kavitationsvorkommens^{führen 3,38, 39}. Daher muss die Spannung, die in den Leitungen arbeitet, gelöst werden, um die artefaktuelle Kavitation^3,12,39zu vermeiden.

Die Gefrier-Fraktur-Technik mit einem In einer Probenkammer installierten Messer wird häufig eingesetzt, um Probenoberfläche für kryo-SEM-Beobachtungen freizulegen. Gefrierfrakture Ebenen von holzigem Pflanzengewebe, insbesondere Querabschnitte von sekundärem Xylem, sind jedoch zu rau, um die anatomischen Merkmale und das Wasser im Gewebe deutlich zu beobachten⁶. Die Anwendung eines Kryostats zum Trimmen einer Probe ermöglicht eine schnelle und qualitativ hochwertige Aufbereitung von Probenoberflächen^20,23. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Elektronenmikroskopie Auflösung der Wasserverteilung in verschiedenen Arten von Xylem-Zellen in situ ohne das Auftreten von Probenahmeartefakten. Wir führen unser aktualisiertes Verfahren ein, das seit unserer einführung stetig verbessert wurde, in Bezug auf die Probenahme, das Trimmen und die Reinigung der Probenoberfläche zur Gewinnung hochwertiger Elektronenmikroskopie von kryofixierten Xylemproben.