JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
유전학

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

Published: April 11, 2019
doi:
10.3791/59086
, , ,
1Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

ТРИФОСФАТЫ-Cas — это мощная технология инженер комплекс геномов растений и животных. Здесь мы подробно протокол эффективно редактировать генома человека с использованием различных эндонуклеазами Cas. Мы отмечаем важные соображения и расчетные параметры для оптимизации эффективности редактирования.

Abstract

Кластерный системы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) функции естественно в бактериальных адаптивного иммунитета, но успешно многократно использовать для генома инженерии в многих различных живых организмов. Чаще всего Cas12a эндонуклеазы используется прилепится определенных сайтов в геноме, после чего перерыв двуцепочечной ДНК будет восстановлена через не гомологичных конце присоединения (NHEJ) путь или ориентированные на гомологии ремонт (или wildtype ТРИФОСФАТЫ связанные 9 (Cas9) HDR) путь в зависимости от того, является ли шаблон доноров отсутствует или представить соответственно. На сегодняшний день, ТРИФОСФАТЫ систем от различных видов бактерий было показано, чтобы быть способными выполнять изменения генома в mammalian клетках. Однако несмотря на кажущуюся простоту технологии, несколько конструктивных параметров должны рассматриваться, которые часто оставляют пользователи недоумевали о том, как лучше всего выполнять их геном редактирования экспериментов. Здесь мы описываем полный рабочий процесс из экспериментального дизайна для идентификации ячейки клонов, которые несут желаемые изменения ДНК, с целью облегчения успешного выполнения редактирования эксперименты в mammalian клетки линии генома. Мы подчеркиваем основные соображения для пользователей, чтобы принять к сведению, включая выбор системы ТРИФОСФАТЫ, длина распорку и дизайн шаблона доноров одноцепочечной oligodeoxynucleotide (ssODN). Мы предполагаем, что этот процесс будет полезен для гена нокаут исследований, моделирования усилия, болезни или поколения репортер мобильных линий.

Introduction

Способность инженер геном любого живого организма имеет много биомедицинских и биотехнологических приложений, например коррекции болезнетворные мутации, строительство точных моделей для исследования заболеваний, или поколения сельскохозяйственных культур с желательные черты. С начала века, различные технологии были разработаны для техники генома клеток млекопитающих, включая meganucleases1,2,3, цинковый палец nucleases4,5, или Транскрипция эффекторных активатор как nucleases (Таленс)6,,78,9. Однако эти более ранних технологий трудно программы или утомительно собрать, препятствуя тем самым их широкое распространение в научных исследований и промышленности.

В последние годы кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) – связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) системы стала мощной новой генома, инженерные технологии10,11. Первоначально адаптивной иммунной системы в бактерии, он был успешно развернут для модификации генома растений и животных, включая человека. Основная причина, почему ТРИФОСФАТЫ-Cas популярность так много за такое короткое время, что элемент, который приносит ключевых эндонуклеазы Cas, например Cas9 или Cas12a (также известный как Cpf1), в нужное место в геноме это просто небольшой фрагмент химерных единого руководства RN A (sgRNA), которая является простой дизайн и дешевые синтезировать. После набираются на целевой сайт, Cas фермента функционирует как молекулярные ножницы и расщепляет ДНК связанного с его RuvC, HNH или КНУ доменов12,,1314. Результате двойной мель перерыв (DSB) впоследствии отремонтированы клетки через ориентированные на гомологии ремонт (HDR) путь или не гомологичных конце присоединения (NHEJ). В отсутствие шаблона ремонт DSB отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, который может привести к псевдо-случайных вставки или удаления нуклеотидов (indels) в месте разреза, потенциально вызывая фреймшифт мутации в генах, белок кодирования. Однако в присутствии доноров шаблон, содержащий требуемые изменения ДНК, DSB восстановлена дорожка HDR высокой верности. Общие типы доноров шаблоны включают одноцепочечной олигонуклеотиды (ssODNs) и плазмид. Бывший обычно используется, если предполагаемого изменения ДНК небольшие (например, изменение одной пары базы), в то время как последние обычно используется, если один хочет, чтобы вставить относительно длинная последовательность (например, кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка или GFP) в целевой Локус.

Эндонуклеазы активность белка Cas требует наличия protospacer прилегающие мотив (PAM) на целевой сайт15. Пэм Cas9 находится в конце 3′ protospacer, в то время как Пэм Cas12a (также называемый Cpf1) находится в конце 5′ вместо16. Cas руководство РНК комплекс не в состоянии представить DSB, если PAM отсутствует17. Следовательно PAM места ограничения в геномной местах, где особенно нуклеиназы Cas способен расщеплять. К счастью Cas nucleases из различных видов бактерий обычно демонстрируют различные требования PAM. Таким образом путем интеграции различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas в наших инженерных инструментов, мы можем расширить круг сайтов, которые могут быть направлены в геноме. Кроме того естественный фермент Cas может быть спроектирован или эволюционировали признать альтернативных последовательностей PAM, дальнейшего расширения масштабов геномной целей доступным для манипуляции18,19,20.

Хотя несколько ТРИФОСФАТЫ-Cas системы доступны для технических целей генома, большинство пользователей технологии полагались главным образом на Cas9 Нуклеаза от Streptococcus pyogenes (SpCas9) по нескольким причинам. Во-первых он требует относительно просто NGG Пэм, в отличие от многих других белков Cas, которые может только расщеплять при наличии более сложных пам. Во-вторых это первый Cas эндонуклеазы успешно развернуты в клетки человека21,,2223,24. В-третьих SpCas9 является на сегодняшний день лучше всего характеризуется фермент на сегодняшний день. Если исследователь хочет использовать другой нуклеиназы Cas, он или она часто будет ясно о том, как лучше разработать эксперимент, и насколько хорошо другие ферменты будет выполнять в различных биологических условиях по сравнению с SpCas9.

Чтобы внести ясность в относительной эффективности различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas, мы провели недавно систематическое сравнение пяти Cas эндонуклеазами – SpCas9, Cas9 фермента от золотистого стафилококка (SaCas9), энзим Cas9 от Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a фермента от Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) и Cas12a фермента от бактерия Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. За справедливое сравнение мы оценивали различные Cas nucleases, используя тот же набор целевых объектов и других экспериментальных условий. Исследование также определила дизайн параметры для каждой системы ТРИФОСФАТЫ-Cas, которая будет служить полезным справочным материалом для пользователей технологии. Здесь, чтобы лучше включить исследователей использовать ТРИФОСФАТЫ-Cas системы, мы предоставляем пошаговые протокол для оптимального генома техники с различными Cas9 и Cas12a ферменты (см. Рисунок 1). Протокол включает не только экспериментальных детали, но также важных конструктивных соображений необходимо максимизировать вероятность успешного генома инженерных решений в mammalian клетках.

Figure 1
Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса для создания генома линий клеток человека отредактированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. дизайн sgRNAs Выберите соответствующую систему ТРИФОСФАТЫ-Cas. Во-первых проверьте целевого региона для PAM последовательности всех Cas9 и Cas12a nucleases, которые показали, чтобы быть функциональным в mammalian клетках16,21-32. Пять часто используемые ферменты приведены в таблице 1</stro…

Representative Results

Для выполнения генома редактирования эксперимент, ТРИФОСФАТЫ плазмида, выражая sgRNA ориентации, локус интерес должен быть клонированы. Во-первых плазмида переваривается с энзима ограничения (обычно типа IIs фермент) для линеаризации его. Рекомендуется для устранения переваривается прод…

Discussion

Система ТРИФОСФАТЫ-Cas является мощным, революционная технология для инженер геномов и transcriptomes растений и животных. Содержат ТРИФОСФАТЫ-Cas систем, которые потенциально могут быть адаптированы для генома и транскриптом инженерных целей44были найдены многочисленные виды бак…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. поддерживается агентства грант для Объединенного бюро Совета науки, технологий и научных исследований (1431AFG103), Национальный совет медицинских исследований Грант (OFIRG/0017/2016), Национальный исследовательский фонд предоставляет (NRF2013-THE001-046 и NRF2013-THE001-093), Министерство образования Tier 1 Грант (RG50/17 (S)), запуска грант от Nanyang технологический университет и фондов для генетически Инженерная машина (МПСЭ) международного конкурса от Nanyang технологический университет.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media – – 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. 유전학. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Tags

CRISPR-Cas9Genome EditingMammalian Cell LinesKnock-outKnock-inCell PassagingTrypsin-EDTATransfectionFACSFluorescent MarkerCell Culture MediumGenomic DNA Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image