المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51
Summary
وقد وضعت الأسفار الرنين الطاقة المستندة إلى نقل في الوقت الحقيقي مراقبة نظم من الحمض النووي حبلا تبادل رد فعل توسط Rad51. استخدام البروتوكولات المقدمة هنا، نحن قادرون على الكشف عن تشكيل رد فعل المواد الوسيطة وتحويلها إلى منتجات، بينما أيضا تحليل الحركية الانزيمية من رد فعل.
Abstract
تفاعل تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51 خطوة حاسمة جزئ مثلى. في رد الفعل هذا، يشكل خيوط البروتين النووي على واحد–الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنا) Rad51 ويلتقط مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) غير خصيصا لاستجواب ذلك لتسلسل مثلى. بعد أن واجهت التماثل، يحفز Rad51 تبادل حبلا الحمض النووي للتوسط في إقران حبلا مكملة دسدنا سدنى. هذا رد فعل جداً ينظم البروتينات أكسيساري عديدة في فيفو. على الرغم من أن فحوصات الكيمياء الحيوية التقليدية قد استخدمت بنجاح دراسة دور هذا البروتين التبعي في المختبر، تحليل الحركية لتشكيل الوسيطة والتقدم به إلى منتج نهائي ثبت صعبة نظراً وسيطة طبيعة رد فعل عابر وغير مستقر. لمراقبة هذه الخطوات رد فعل مباشرة في الحل، نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)-على أساس المراقبة في الوقت الحقيقي وأنشئت نظم لرد الفعل هذا. ويبين تحليل الحركية للملاحظات في الوقت الحقيقي أن يطيع حبلا الحمض النووي تبادل رد فعل توسط Rad51 نموذج رد فعل الخطوات الثلاث التي تشمل تشكيل ثلاثة-حبلا الحمض النووي المتوسطة، ونضج هذا المتوسط، والإفراج عن سدنى من متوسطة ناضجة. مجمع Swi5-Sfr1، بروتين أكسيساري في حقيقيات النوى، يعزز بقوة الخطوات الثانية والثالثة من رد الفعل هذا. فحوصات المستندة إلى الحنق المعروضة هنا تمكننا من الكشف عن الآليات الجزيئية عن طريق أي جزئ تحفيز البروتينات accessary نشاط تبادل حبلا الحمض النووي Rad51. والهدف الأساسي من هذا البروتوكول تعزيز مرجع التقنيات المتاحة للباحثين في ميدان جزئ مثلى، لا سيما أولئك الذين يعملون مع البروتينات من الأنواع الأخرى شيزوساكتشاروميسيس بومبي، حيث ويمكن تحديد الحفظ التطوري للنتائج المعروضة هنا.
Introduction
جزئ المتجانسة (HR) يسهل خلط المعلومات الوراثية بين اثنين من جزيئات الحمض النووي مختلفة. الموارد البشرية ضروري للظواهر البيولوجية الأساسية هما: توليد التنوع الوراثي خلال الجاميطات1 وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (دسبس)2 أثناء الانقسام. دسبس أشد أشكال الضرر الحمض النووي وتشكل على كسر في الكروموسوم. يمكن أن يسبب غير صحيحة إصلاح دسبس ترتيبات جديدة الصبغية واسعة النطاق وعدم الاستقرار المجيني، التي هي كل السمات المميزة للسرطان3.
هو رد فعل تبادل حبلا الحمض النووي المرحلة الوسطى من الموارد البشرية. بروتين Rad51، وعضو في الأسرة RecA-نوع يحافظ على درجة عالية من ريكومبيناسيس، هو البروتين الرئيسي الذي يحفز رد الفعل هذا في حقيقيات النوى4،5. في رد الفعل هذا، Rad51 بربط واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنى) التي تم إنشاؤها عن طريق تجهيز نوكليوليتيك من نهاية جهاز تسوية المنازعات، وأشكال البروتين النووي حلزونية معقدة تسمى خيوط presynaptic. هذه الشعيرة المصيد سليمة من الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) نونسبيسيفيكالي للبحث عن تسلسل مثلى. عندما يعثر خيوط تسلسل مثلى، يتم تشكيل رد فعل وسيطة تحتوي على الحمض النووي الثلاثة–الذين تقطعت بهم السبل وخيوط Rad51 يتوسط تبادل حبلا داخل هذا الهيكل6،،من78. ولتحقيق هذا التفاعل كفاءة، يتطلب Rad51 عدة أنواع من البروتينات التبعي مثل BRCA1 و BRCA2، منتجات من الثدي السرطان قابلية الجينات9،10.
فهم كيفية تنظيم عوامل ملحق Rad51 خطوة متكاملة في الكشف عن أسباب عدم الاستقرار المجيني أثناء توموريجينيسيس. على الرغم من أن الكثير من البحوث يهتم بآثار هذه العوامل على تكوين خيوط presynaptic والاستقرار11،،من1213،14،،من1516، مساهمة هذه العوامل في تشكيل متوسطة ثلاث حبلا وتجهيزها في المنتج النهائي لا يزال غير واضح. مراقبة رد فعل الخطوات من خلال تجارب الكيمياء الحيوية التقليدية صعب جداً لأن متوسط ثلاثة ستراند غير مستقرة وعرضه للانهيار بالتلاعب التجريبية المشتركة مثل ديبروتينيزيشن عينات أو التفريد.
للتغلب على هذه المشكلة، ونحن تكييفها نظامين المتقدمة سابقا المراقبة في الوقت الحقيقي من الحمض النووي حبلا رد فعل تبادل استخدام نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق): الأقران حبلا الحمض النووي والحمض النووي حبلا التشرد فحوصات17، 18 (الشكل 1). في حبلا الحمض النووي الأقران المقايسة، أشكال Rad51 خيوط بريسينابتيك مع فلوريسسين أميديتي (الاتحاد الماليزي)-المسمى سدنى والمتجانسة ثم كاربوكسي-س-والرودامين (روكس)-المسمى دسدنا يضاف إلى الشروع في رد فعل تبادل حبلا. عندما يمسك دسدنا المسمى بلول خيوط وأشكال المتوسطة ثلاثة ستراند، فلوروفوريس اثنين حيز مقربة والأسفار انبعاث الاتحاد الماليزي هو مروي روكس (الشكل 1A). في مقايسة التشرد حبلا الحمض النووي، هو المحتضنة خيوط presynaptic شكلت في سدنى غير مسمى مع الاتحاد الماليزي وروكس دسدنا المسمى مزدوجة. عندما يتم إكمال تبادل حبلا وهو الإفراج عن الاتحاد الماليزي المسمى سدنى من الثلاثة-حبلا وسيطة، انبعاث الزيادات الاتحاد الماليزي لأنه لم يعد الاتحاد الماليزي بالقرب من روكس (الشكل 1B). هذه فحوصات تمكننا من مراقبة تشكيل ثلاثة ستراند وسيطة وتجهيزها في المنتجات النهائية في الوقت الحقيقي دون أي اضطرابات لرد الفعل.
باستخدام هذا النظام المراقبة في الوقت الحقيقي، وجدنا أن حبلا الحمض النووي تبادل رد فعل توسط Rad51 العائدات في الخطوات الثلاث بما في ذلك تشكيل أول رد فعل الوسيطة (C1)، والانتقال من المتوسطة الأولى إلى متوسطة الثانية (C2)، والإفراج عن سدنى من C219. كما وجدنا أن انشطار الخميرة (بومبي س.) يحفز Sfr1 Swi5، وهو حفظت تقحم Rad51 بروتين التبعي معقدة13،16،20،21،22، الانتقال C1-C2 والإفراج عن سدنى من C2 بطريقة تعتمد على التحلل المائي ATP Rad5119.
إذا حفظت هذه النتائج هي تقحم لا يزال غير معروف. ويرد هذا البروتوكول مع الأمل في أن الباحثين في مجال الموارد البشرية، لا سيما أولئك الذين يعملون مع البروتين من الكائنات الحية خلاف بومبي س، يمكن تطبيق هذه التقنيات لتحديد إلى أي مدى الآلية الجزيئية ليحركها Rad51 هو يحافظ تبادل حبلا. وعلاوة على ذلك، أثبتت هذه التقنيات ناجحة للغاية في تحديد دور بومبي س. Swi5-Sfr1. وبالتالي، فمن تنبؤ رشيد أن هذه التقنيات لا تقدر بثمن في الكشف عن الأدوار الدقيقة من العوامل الأخرى التبعي في الموارد البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، لقد قمنا بوصف بروتوكول تفصيلية التي تستخدم الحنق لقياس تبادل حبلا الحمض النووي يحركها Rad51 في الوقت الحقيقي. الأهم من ذلك، تسمح هذه القياسات لتحديد رد الفعل حركية. بينما الأوصاف المذكورة أعلاه كافية لاستخراج النتائج المنشورة، وهناك العديد من النقاط الحرجة التي سوف الموصوفة في هذا المقطع. وعلاوة على ذلك، مزايا وعيوب المنهجيات القائمة على الحنق لدراسة الحمض النووي حبلا الصرف ستناقش، جنبا إلى جنب مع تطبيق هذه التقنيات على دراسة الجوانب الأخرى من استقلاب الحمض النووي.
كما هو الحال مع جميع ريكونستيتوشنز الكيمياء الحيوية، من الضروري ضمان أن كل رد فعل ركائز درجة نقاء عالية. ومن الإهمال افتراض عدم وجود أنشطة تلويث يستند فقط إلى نقاء الظاهر من إعداد البروتين الحكم من خلال أخذ تلطيخ. على وجه الخصوص، وجود كميات ضئيلة من نوكليسيس أو هيليكاسيس يمكن أن يؤثر بشدة على نتائج فحوصات الأقران والتشرد. وهكذا، نحن نشجع بقوة إجراء التجارب لمثل هذه الأنشطة في كل مرة يتم تنقيتها دفعة جديدة من البروتين. وعلاوة على ذلك، فإنه من الحكمة لفحص نقاء تجميعي الحمض النووي ركائز بالتفريد الأصلية polyacrylamide هلام. وعلى الرغم من العديد من الشركات ضمان نقاء النوكليوتيد، غالباً ما وجدنا من خلال التجارب الخاصة بنا أن النقاء من الحمض النووي المركبة يمكن أن تختلف بين دفعات.
من المهم أن تنظر في النقطتين التاليتين عند إجراء التجارب مع الكوارتز الترعة. أولاً، أن بعض البروتينات المعرضة لربط الترعة الكوارتز نونسبيسيفيكالي. وللتصدي لذلك، يتم تضمين مونولوراتي جيش صرب البوسنة وبوليوكسيثيلينيسوربيتان في مخازن رد فعل. ثانيا، درجة الحرارة له تأثير جذري على شدة الأسفار وسرعة رد الفعل. لتقليل هذا التأثير، ينبغي أن يكون ومبومو الكوارتز المحتضنة مسبقاً في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
ورغم فائدة كبيرة في دراسة الحمض النووي حبلا تبادل فحوصات الكيمياء الحيوية التقليدية، لها عدة عيوب. في تجربة الزمن–دورة نموذجية، هي المحتضنة كرد فعل عند درجة حرارة معينة وسحب في تيميبوينتس المرجوة مختبرين وديبروتينيزيد بالمعاملة مع المنظفات ومبطلات إنهاء رد فعل. عند انتهاء الوقت-الدورة التدريبية، تخضع العينات ثم إلى التفريد لفصل ركائز الحمض النووي من المنتجات. والميزة الرئيسية للطريقة الموصوفة هنا أنه يسمح للمراقبة في الوقت الحقيقي لرد الفعل دون أي اضطراب. يمكن أن تفقد أي تيميبوينت أثناء عملية التفاعل دون انقطاع إلى رد الفعل نفسه وليس هناك حاجة ديبروتينيزي عينات أو إخضاعها لقوى يحتمل أن تكون مدمرة للتفريد. هذا ذات الصلة لا سيما عند رصد مجا هياكل الحمض النووي.
وعلى الرغم من هذه القوة عبر فحوصات التقليدية، قد الأسلوب الموصوفة هنا بعض العيوب. بينما يبسط استخدام ركائز اليغنوكليوتيد الحمض النووي لتبادل حبلا تفسير النتائج، من المهم أن نتذكر أن هذه ركائز لا تشبه ركائز الحمض النووي تشارك في الموارد البشرية في الخلية. وتستخدم بعض الاختبارات التقليدية ركائز الحجم بلازميد الحمض النووي، الذي من المرجح أن تعكس عدد الأزواج الأساسية التي يتم تبادلها فيفو. وعلاوة على ذلك، جزئيا على الأقل إعادة استخدام ركائز دسدنا التعميم توبولوجيكالي مقيدة في مجموعة فرعية فحوصات التقليدية التوترات في الحمض النووي الفسيولوجية.
بدأ تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا لكشف آليات تبادل حبلا يحركها Rad51 الحمض النووي الجزيئي. ومع ذلك، هناك العديد من الأسئلة المثيرة للاهتمام التي لا يزال يتعين الإجابة عليها. وهناك أدلة واضحة على أن الموارد البشرية أثناء الانقسام الاختزالي يتطلب كلا من Rad51 و Dmc1، recombinase RecA-نوع الانقسام على حدة في حقيقيات النوى24. ومع ذلك، عدم وجود اختلافات البيوكيميائية بين هذه ريكومبيناسيس اثنين قد حير الباحثين في المجال لسنوات. وعلاوة على ذلك، كانت أدوار عديدة مجموعات متميزة من العوامل التبعي جزئ موضوع تنسيق البحوث في مجال الموارد البشرية. بالإضافة إلى توضيح الاختلافات البيوكيميائية بين Rad51 و Dmc1، نحن نهدف إلى التحقيق ومقارنة آثار العوامل المختلفة جزئ التبعي في حركية التبادل حبلا الحمض النووي في المستقبل القريب. أخيرا، من المهم التأكيد على أن المنهجية المستندة إلى الحنق الموصوفة هنا لا يقتصر على دراسة تبادل حبلا الحمض النووي. مع تعديلات طفيفة نسبيا، ونحن نتصور العديد من أنواع التطبيقات لهذا الأسلوب في التحقيق البروتينات الوظيفية المتنوعة المشاركة في الحمض النووي الأيض25،26،،من2728. ويحدونا الأمل أن التطورات المذكورة هنا سيوفر المزيد من خيارات للباحثين الذين ينتمون إلى العديد من التخصصات المختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من معونة للبحث العلمي (A) (ح 18 03985) وفي “مجالات مبتكرة” (15 ح 05974) مرحبا، للعلماء الشبان) ب (15061 ك 17) لمكتبة الإسكندرية، و للعلمية البحوث (ب) (ح 18 02371) إلى HT من “جمعية اليابان” (تعزيز العلوم JSPS).
Materials
| 0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
| 1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
| adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
| Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
| Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
| PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
| Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
| Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |
References
- Camerini-Otero, R. D., Hsieh, P. Homologous recombination proteins in prokaryotes and eukaryotes. Annual Review of Genetics. 29 (1), 509-552 (1995).
- Cromie, G. A., Connelly, J. C., Leach, D. R. Recombination at double-strand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans. Molecular Cell. 8 (6), 1163-1174 (2001).
- Pierce, A. J., et al. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends in cell biology. 11 (11), S52-S59 (2001).
- Haber, J. E. . Genome Stability. , (2013).
- Kowalczykowski, S. C. An Overview of the Molecular Mechanisms of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (11), a016410 (2015).
- Bianco, P. R., Tracy, R. B., Kowalczykowski, S. C. DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 3, D570-D603 (1998).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Jentsch, S. Mechanisms and principles of homology search during recombination. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 369-383 (2014).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. The Journal of biological chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Sung, P., Krejci, L., Van Komen, S., Sehorn, M. G. Rad51 recombinase and recombination mediators. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 42729-42732 (2003).
- Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (4), a016600 (2015).
- Sung, P. Function of yeast Rad52 protein as a mediator between replication protein A and the Rad51 recombinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (45), 28194-28197 (1997).
- Sung, P. Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes & Development. 11 (9), 1111-1121 (1997).
- Kurokawa, Y., Murayama, Y., Haruta-Takahashi, N., Urabe, I., Iwasaki, H. Reconstitution of DNA strand exchange mediated by Rhp51 recombinase and two mediators. PLoS biology. 6 (4), e88 (2008).
- Jensen, R. B., Carreira, A., Kowalczykowski, S. C. Purified human BRCA2 stimulates RAD51-mediated recombination. Nature. 467 (7316), 678-683 (2010).
- Liu, J., et al. Rad51 paralogues Rad55-Rad57 balance the antirecombinase Srs2 in Rad51 filament formation. Nature. 479 (7372), 245-248 (2011).
- Lu, C. -. H., et al. Swi5-Sfr1 stimulates Rad51 recombinase filament assembly by modulating Rad51 dissociation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- Bazemore, L. R., Takahashi, M., Radding, C. M. Kinetic analysis of pairing and strand exchange catalyzed by RecA. Detection by fluorescence energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 272 (23), 14672-14682 (1997).
- Gupta, R. C., Bazemore, L. R., Golub, E. I., Radding, C. M. Activities of human recombination protein Rad51. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 463-468 (1997).
- Ito, K., Murayama, Y., Takahashi, M., Iwasaki, H. Two three-strand intermediates are processed during Rad51-driven DNA strand exchange. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 29-36 (2018).
- Akamatsu, Y., Dziadkowiec, D., Ikeguchi, M., Shinagawa, H., Iwasaki, H. Two different Swi5-containing protein complexes are involved in mating-type switching and recombination repair in fission yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15770-15775 (2003).
- Haruta, N., et al. The Swi5-Sfr1 complex stimulates Rhp51/Rad51- and Dmc1-mediated DNA strand exchange in vitro. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (9), 823-830 (2006).
- Argunhan, B., Murayama, Y., Iwasaki, H. The differentiated and conserved roles of Swi5-Sfr1 in homologous recombination. FEBS Letters. 591 (14), 2035-2047 (2017).
- Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase. Analytical biochemistry. 237 (2), 260-273 (1996).
- Brown, M. S., Bishop, D. K. DNA strand exchange and RecA homologs in meiosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (1), a016659 (2014).
- Rudert, W. A., et al. Double-labeled fluorescent probes for 5′ nuclease assays: purification and performance evaluation. BioTechniques. 22 (6), 1140-1145 (1997).
- Xiao, J., Singleton, S. F. Elucidating a key intermediate in homologous DNA strand exchange: structural characterization of the RecA-triple-stranded DNA complex using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Molecular Biology. 320 (3), 529-558 (2002).
- Grimme, J. M., et al. Human Rad52 binds and wraps single-stranded DNA and mediates annealing via two hRad52-ssDNA complexes. Nucleic Acids Research. 38 (9), 2917-2930 (2010).
- Algasaier, S. I., et al. DNA and Protein Requirements for Substrate Conformational Changes Necessary for Human Flap Endonuclease-1-catalyzed Reaction. The Journal of biological chemistry. 291 (15), 8258-8268 (2016).
