Gestione e valutazione della cultura umana Organoid primario della prostata

Il seguente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali prostatiche primarie umane raccolte dal tessuto del paziente presso la University of Illinois at Chicago Hospital. Tutti i tessuti umani utilizzati per questi esperimenti sono stati acquisiti tramite un Institutional Review Board-approvato protocollo e/o esenzione presso la University of Illinois a Chicago. Mentre le condizioni della coltura varia secondo il tipo di cella di interesse, gli endpoint possono essere applicati a organoids di altri tessuti. 1. semina delle cellule epiteliali in gel “Matrix” e la sostituzione del supporto Raccogliere i materiali necessari: primarie cellule epiteliali prostatiche umane (PrE), gel “matrix” su ghiaccio, micropiastra a 96 pozzetti, dei cheratinociti privo di siero media (KSFM) sul ghiaccio, carboncino spogliato siero bovino fetale (FBS) e il diidrotestosterone (DHT). Preparare supporti basati su KSFM organoid combinando 47,5 mL di KSFM con 2,5 mL di carbone FBS spogliato e diidrotestosterone (DHT) a una concentrazione finale di 10 nM DHT, quindi riserva sul ghiaccio. Celle di piastra in una matrice 3D in una cappa di cultura cellulare utilizzando una tecnica sterile. Delicatamente freddo mix media basati su KSFM organoid con gel di matrice ghiacciata per ottenere una matrice di 50% gel miscela di lentamente su e giù il pipettaggio, evitando bolle.Nota: Matrix gel dovrebbe essere scongelati durante la notte a 4 ° C e tenuta su ghiaccio quando possibile. Si solidifica rapidamente a temperatura ambiente (TA). Pre-bagnato un puntale in media freddo e trasferimento 40 – 50 μL di 50% matrice del gel sul fondo di ciascun pozzetto per essere utilizzato su una piastra a 96 pozzetti. Ricoprire il fondo del pozzo per formare uno strato di base.Nota: Non versare completamente alla seconda fermata sulla pipetta, come questo può creare bolle. Inserire la piastra a 96 pozzetti in incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min a solidificare lo strato di base.Nota: Non piastra cellule epiteliali sul livello base fino a quando non è solidificato, o cellule possono cadere attraverso la matrice sul fondo del piatto e crescere come uno strato monomolecolare. Mescolare cellule epiteliali sospese nei mezzi di comunicazione basati su KSFM organoid con gel di matrice per ottenere una concentrazione finale di 100 – 1.000 cellule/100 μL e 33% gel “matrix”. Cellule epiteliali piastra sopra strati di base utilizzando 100 μL di miscela di 33% matrice gel/cellule per pozzetto.Nota: Gli esperimenti precedenti hanno dimostrato che semina di cellule epiteliali troppo densamente in 3D limiterà la dimensione di crescita organoid, mentre semina troppo scarsamente può provocare la bassissima resa13. È importante ottimizzare le condizioni di semina per il tipo di cella di interesse, basata sull’efficienza di formazione di paziente-specific organoid. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min consentire il gel “matrix” a solidificare, poi delicatamente aggiungere 100 μL di media basato su KSFM organoid sopra cellule pipettando lentamente contro il bordo del pozzo. Modificare i media ogni 2 – 3 giorni. Pipettaggio contro il lato del pozzo con spazio tra il gel di media e matrice, rimuovere delicatamente 50 μL di media e sostituire con 50 μL di mezzi freschi.Nota: Per una cultura a lungo termine, il gel di matrice deve essere cambiato ogni 2 – 3 settimane. Se la cultura di matrice gel vengono visualizzate traslucide rughe sotto il microscopio e instabile, il gel “matrix” ha abbattuto e deve essere sostituito. 2. raccolta dei Organoids da gel “Matrix” Nota: Insieme di organoids è necessaria per le modifiche di matrice gel, passaggio o endpoint di estrazione del RNA, DNA estrazione, estrazione di proteine e citometria a flusso. Proteasi neutre calde e Hanks’ equilibrata soluzione salina (HBSS) in bagnomaria a 37 ° C. Rimuovere con cautela la media da pozzi senza interrompere il gel “matrix”. Aggiungere ~ 200 μL di proteasi neutre a ciascun pozzetto in un ~ 1:2 rapporto della proteasi di matrice gel: neutro e incubare per 20 min a 37 ° C. Meccanicamente è possibile dissociare la miscela di proteasi di matrice gel: neutro pipettando su e giù. Incubare per 20 min a 37 ° C. Trasferire il composto di cellula del gel neutro proteasi-matrice in un tubo del microcentrifuge o tubo conico, a seconda del volume. Centrifugare a 300 x g per 3 – 5 min agglomerare le cellule.Nota: Se viene visualizzata la finestra di nessun pellet cellulare, il gel di matrice non può essere dissociato completamente e può essere visualizzato come una fase trasparente nella parte inferiore del tubo distinto dal surnatante rosa. Eliminare il surnatante e aggiungere più neutrale della proteasi con un rapporto di 1:2 a matrice il pellet di gel, incubare per un altro 20 – 40 min a 37 ° C e ripetere la centrifugazione a 300 x g. Quando viene acquisito un pellet organoid, eliminare il surnatante. Procedere con il passaggio (Vedi punto 2.7.1), organoid Lisi per l’estrazione di RNA, DNA o proteine (Vedi punto 2.7.2), cellule di elaborazione singola da citometria a flusso e l’ordinamento di singola cellula (Vedi punto 2.7.3). Per coltura a lungo termine, Risospendere delicatamente organoids intatto in 33% matrice fresco gel e piastra seguendo la procedura descritta nei passaggi 1.1 – 1.5. Per dissociare organoids e replate come celluli, risospendere il pellet in 1 mL di enzimi calda cella-dissociazione e incubare a 37 ° C per 10 – 15 min, lavare una volta con 5 mL di HBSS e ri-lastra nel gel fresco matrice seguendo passaggi 1.1 – 1.5. Risospendere il pellet di organoid in un buffer di lisi appropriato per l’estrazione del RNA, estrazione del DNA o estrazione della proteina, come elencato nella Tabella materiali e seguire il protocollo del produttore. Risospendere organoids in 1 mL di enzimi calda cella-dissociazione e incubare a 37 ° C per 10 – 15 min dissociare il organoids in singole celle. Lavare una volta con 5 mL di HBSS e procedere con il protocollo per flusso cytometry5 o cella singola sequenza18.Nota: Per annullare l’associazione in singole celle a basse concentrazioni di gel “matrix”, la proteasi neutra non possono essere necessari, e gli enzimi cellulari-dissociazione possono essere applicati direttamente al pozzo dopo passo 2.2. 3. tutto-pozzo immagine acquisizione e l’analisi della morfologia Organoid Acquisire immagini tutto-ben z-stack utilizzando un microscopio invertito luce trasmesso con un motorizzato X / Y scansione fase (flusso di lavoro illustrato in Figura 1A). Con la posizione focale regolata sul fondo del pozzo, iniziare a concentrarsi verso l’alto finché non viene rilevato il primo organoid, che sarà al centro del pozzo a causa del menisco dal livello di base. Impostare il piano z inferiore in questa posizione. Continua messa a fuoco verso l’alto fino a quando l’ultimo organoid è a fuoco, che sarà nella periferia del pozzo. Impostare il z-piano superiore in questa posizione.Nota: Dopo aver impostato la parte superiore e inferiore dello z-stack, assicurarsi che queste posizioni catturano il organoids all’interno di tutti i restanti pozzetti e regolare il superiore/inferiore, se necessario. Questo permette la gamma z da utilizzare per una singola scansione che include ogni organoid all’interno di ciascun pozzetto. Acquisire 15 – 35 z-aerei per pozzetto, utilizzando un numero maggiore per una maggiore risoluzione. Catturare l’intera immagine bene, unire e raccogliere quadranti o sottosezioni se necessario.Nota: Si consiglia di prendere z-piani multipli al contrario di un singolo piano z, come illustrato in Figura 1B in cui organoids sono fuori fuoco durante l’acquisizione di un solo piano z. Salvare le immagini di z-stack per analisi a valle. Analizzare le immagini utilizzando il software di immagine con capacità di disegno a mano libera. Aprire una singola immagine di piano z impostare dal punto 3.1.4. Se necessario, affiancare le immagini scattate a ogni singolo piano z in un’immagine singola, tutto-bene. Salvare la nuova immagine come un file separato. Ripetere questo processo per ogni z-plane acquisito. Utilizzando il software di immagine, aprire l’immagine intera-pozzo per ogni z-plane da un singolo pozzo e creare un’estensione della profondità di campo (EDF) immagine dallo stack di z-aerei.Nota: Questo tipo di immagine selezionerà la migliore regione di messa a fuoco di ogni z-plane per creare una singola immagine di messa a fuoco del pozzo. Impostare la scala di pixel del software per la barra della scala dell’immagine che si sta misurando. Utilizzando lo strumento di disegno a mano libera del software image, tracciare il perimetro di ogni organoid nel pozzo. Ottenere le metriche di misurazione per perimetri organoid tracciata dal software immagine.Nota: I parametri raccomandati sono area, circolarità e rapporto massimo/minimo raggio. Risultati rappresentativi che illustra l’applicazione di queste metriche sono mostrati in Figura 1. Area è calcolata dal poligono definito dal perimetro di organoid. La circolarità è il rapporto tra l’area di organoid per l’area di un cerchio con furetto massimo di diametro uguale il organoid, dove 0 è meno circolare e 1 è più circolare. Raggio di massimo/minimo rapporto è il rapporto tra il raggio massimo e minimo raggio del tracciato organoid.Circolarità =Rapporto raggio = 4. paraffina e fissazione in formalina incorporamento dei Organoids per gli endpoint istologici Preparare l’incorporamento forniture: HBSS, soluzione al 2% agar, istologico marcatura tinture, gel di istologia, pipettare punta muffa, nastro, stantuffo da una siringa da insulina 1 cc, impacco di ghiaccio, cassette, Formalina 10% neutra tamponata (NBF), matita ed etanolo (EtOH) di grado istologico di 75%. Preparare due provette per microcentrifuga di soluzione al 2% agar. Incubare in un bagno d’acqua o su un blocco di calore a 100 – 110 ° C per mantenere agar in forma liquida. Aggiungere 1-2 gocce di istologico marcatura colorante per una delle soluzioni 2% agar, che si denotano la parte superiore dell’agar spina e al mantenimento di orientamento durante l’incorporamento. Mescolare bene. Caldo il gel di istologia in un blocco di calore o vasca di acqua a 55 – 65 ° C. Utilizzando un puntale di 1000 μL, creare stampi tagliando fuori una piccola sezione della punta della pipetta per rendere un cilindro che contiene ~ 50 μL. Creare un secondo, più ampio di stampo che si adatta intorno allo stampo primo. Creare un blocco freddo eseguendo il wrapping di un impacco di ghiaccio con nastro (lato adesivo verso l’alto) e aderendo stampi al nastro. Creare uno stantuffo rimuovendo lo stantuffo da una siringa da insulina 1 cc. Incorporare il organoids in una spina di gel di istologia per l’elaborazione, seguendo il flusso di lavoro raffigurato in Figura 2A. Dissociare il gel “matrix” e pellet organoids seguendo passaggi 2.1 – 2,7. Lavare la pallina organoid una volta con 1 mL di HBSS e ri-pellet spinning per 3 – 5 minuti a 300 x g e rimuovendo il supernatante. Risospendere il pellet di organoid in 30 – 50 μL di gel liquido istologia. Mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Trasferire la miscela di gel/organoid istologia in uno stampo sul blocco freddo e consentire l’esemplare raffreddare e solidificare in una spina. Utilizzare uno stantuffo per spingere la spina dalla piccola muffa e nello stampo più grande. Pipettare chiaro 2% agar intorno alla candela per riempire lo stampo più grande. Pipettare istologico agar 2% colorato di tintura in cima la spina per denotare la parte superiore del campione. Una volta raffreddato, è possibile utilizzare un pistone per trasferire la spina in una cassetta di istologia. Etichettare la cassetta utilizzando una cassetta matita e posto in 10% NBF per fissazione durante la notte. Trasferire la cassetta da 10% NBF al grado istologico 70% EtOH. Processo il gel di istologia spina utilizzando un protocollo di biopsia pre-impostati su un processore, se disponibile. Se predefinito non è disponibile, inserire la seguente sequenza e lunghezze: 70% EtOH per 6 min, 70% EtOH per 10 min, 80% EtOH per 10 min, 95% EtOH 2 volte per 10 min, 100% EtOH 3 volte per 10 min, xilene 3 volte per 15 min , e paraffina 3 volte per 15 min. deviando da quella raccomandata sequenza di elaborazione può provocare la rottura organoids (Figura 3A). Incorporare la spina del gel di istologia con la parte colorata rivolta verso l’alto, in modo che la parte scolorita contenente il organoids per essere sezionato in prima. Sezione l’istologia FFPE blocchi del gel: Raccogliere le forniture necessarie: l’istologia FFPE gel penna di istologia, bagnomaria tessuto galleggiante, blocchi, secchiello con ghiaccio, microtomo, microtomo lame, l’incorporamento di workstation, vetrini da microscopio e laboratorio forno caricato positivamente. Riempimento a bagnomaria fino a quando è molto pieno e insieme a 40 ° C, poi il forno di preriscaldamento laboratorio a 45 – 50 ° C. Preparare un secchio di ghiaccio, poi riempire con ghiaccio e aggiungere acqua per creare un impasto di acqua e ghiaccio. Chill, i blocchi di ghiaccio fino a quando sono molto fredde.Nota: Blocchi possono essere impostati sul ghiaccio per fino a 1 giorno, ma se lasciato durante la notte, i blocchi saranno diventati idratati e avrà bisogno di essere rielaborato. Inserire un blocco nel morsetto di microtomo, aggiungere la lama del portalama e sbloccare eventuali misure protettive di bloccaggio sulla macchina. Iniziare tagliando la faccia del blocco paraffina (fronte al largo) con uno spessore di 10 µm. Una volta che una sezione emerge che contiene l’area di spina, interrompere l’operazione di taglio, bloccare il rotore del microtomo e trasferire il blocco indietro sul ghiaccio per raffreddare. Se diversi isolati devono essere sezionato, face-off ogni blocco prima di passare al passo 4.5.6. Spostare la lama in una nuova parte inutilizzata e trasferire il blocco indietro al morsetto. Sbloccare la macchina e iniziare rifilatura a 5 μm per ogni sezione.Nota: 5 μm è consigliato per ottenere i migliori risultati, ma 3 – 10 μm è anche accettabile. Con una pinzetta, trasferire la sezione a bagno d’acqua di 40 ° C e consentire la sezione stendere. Trasferire la sezione su un vetrino immergendo verticalmente in acqua.Nota: Immersione in un angolo può trasferire le bolle dal fondo della vasca alla sezione e causare la distorsione del campione. Visualizzare la sezione al microscopio (Figura 2BC).Nota: Se un organoid presente, apparirà simile alla freccia rossa in figura 2B. Bolle (Figura 2B, freccia blu) possono apparire simile a organoids e sono più facili da discernere in una diapositiva di fresco asciutto organoids appaiono traslucide (Figura 2). Se nessun organoids sono presenti, sezione ulteriormente nel blocco. Quando sono state acquisite diapositive contenenti organoids, cerchio della zona intorno alla sezione sul retro della diapositiva con una penna di istologia e cuocere durante la notte a 45 – 50 ° C. Raccogliere le diapositive e procedere alla H & E (Vedi punto 4.9.1), immunohistochemical (vedere il passaggio 4.9.2), o immunofluorescenza colorazione (vedi passo 5).Nota: I risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3B. Per eseguire H & E che macchia, ottenere un kit dalla lista materiali e seguire le specifiche del produttore. Per eseguire la macchiatura di immunohistochemical, ottenere un kit e l’anticorpo primario dall’elenco materiali e seguire le specifiche del produttore. 5. immunofluorescenza colorazione di FFPE e sezionato Organoids Raccogliere le forniture: scivolo al forno dal passaggio 4, xilene, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, acqua deionizzata (DI H2O), coplin vasetti, 1x salino di antigene recupero soluzione tampone citrato di sodio, o tampone Tris-EDTA, tampone fosfato (PBS), 5% cavallo normale del siero ( NHS) con un detergente non ionico 0.1% in PBS, 1% di albumina di siero bovino (BSA) con un detergente non ionico 0,3% in PBS, rack di colorazione, colorazione, decloaking camera, barriera idrofoba penna, camera umida, 1 ° e gli anticorpi di 2 ° di interesse e citoplasmiche di interesse. Deparaffinizzare e reidratare le diapositive immergendo in coplins riempito con le seguenti soluzioni: xilene (3 salse, 5 minuti ciascuno), 100% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna), 95% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna), 70% EtOH (2 tuffi, 3 min ciascuna) e DI H2O (2 DIP 3 min. ciascuno). Riempire il piatto di colorazione con soluzione di smascheramento dell’antigene e cipollotto camera di preriscaldamento a 100 ° C. Eseguire il ricupero dell’antigene immergendo diapositive nel piatto colorazione pre-riscaldato e incubare per 5 – 10 min a 100 ° C. Una volta che il ciclo è completo, fare la camera cipollotto riposare per 20 min prima di aprire il coperchio. Una volta che il piatto di diapositiva si è raffreddata a RT, mettere il piatto colorazione sotto corrente DI H2O per sciacquare i vetrini per 5 min. Rimuovere le diapositive dal piatto colorazione, disegnare un cerchio intorno al campione con una penna di barriera idrofoba e posare la diapositiva sulla camera di umidità. Bloccare qualsiasi anticorpo specifico non colorazione applicando NHS 5% con un detergente non ionico 0.1% in PBS al cerchio idrofobo intorno al campione (circa 30 μL è necessario per coprire il campione). Lavare in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Aggiungere gli anticorpi 1° (Tabella materiali) diluiti in 1% BSA con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione (circa 30 μL dovrebbe coprire la sezione), quindi incubare per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C in camera umida. Lavare i vetrini in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Aggiungere l’anticorpo 2° diluito in 1% BSA con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione (circa 30 μL coprirà l’area), quindi incubare per 1h a RT in camera umida. Lavare i vetrini coplin riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Aggiungere DAPI, diluito alle specifiche del produttore, in BSA 1% con un detergente non ionico 0,3% in PBS per idrofobo cerchio intorno al campione, quindi incubare per 2 – 5 min a temperatura ambiente al buio (30 μL). Lavare i vetrini in coplins riempito con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Montare i vetrini con mezzi di montaggio antifade e vetrino coprioggetto, quindi visualizzare i risultati sotto un microscopio. 6. tutto-montaggio dei Organoids per la macchiatura immunofluorescente Raccogliere le forniture: camera diapositiva o piatto confocale, tampone fosfato salino (PBS), fissativo, 50mm NH4Cl in PBS, il detergente non ionico 0.1% in PBS, NHS 5% con un detergente non ionico 0.1% in PBS, BSA 1% con un detergente non ionico 0,3% in PBS, 1 ° e 2 ° anticorpi di interesse e citoplasmiche di interesse. Rimuovere con attenzione tanto mezzi possibili senza interrompere la cultura organoid pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra media e matrice di gel. Utilizzando un profilato, pre-bagnato con supporti o PBS, punta della pipetta 1.000 μL, redigere una goccia (25 – 50 µ l) di gel “matrix” che contiene il organoid(s) di interesse ed erogare in mezzo di un piatto ben o confocale camera di diapositiva.Nota: il 33% matrice gel non è un solido. È un liquido gelatinoso che gestisce simile a una gelatina che completamente non è impostata. Un puntale di profilati con una grande apertura impedirà organoids rottura durante i trasferimenti. Se organoids rimangono nella cultura genitore, sostituire il supporto con supporti basati su KSFM caldi. Con l’occhio nudo o ambito di dissezione, aspirare il gel in eccesso di media e matrice dalla diapositiva camera con una pipetta di multa-punta (10 – 200 μL).Nota: È facoltativo pretrattare la diapositiva di camera con un reagente di aderenza. Piastra di un volume uguale di gel “matrix” in un pozzo vuoto della diapositiva camera come un controllo facoltativo osservare autofluorescenza della matrice avanzi. Porre il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C per 30 – 45 min promuovere il organoid per aderire al vetro e prevenire la perdita dei campioni durante le fasi di lavaggio. Pipettare lentamente per evitare il distacco dalla diapositiva, lavare organoids con 200 µ l di PBS 1X per 5 min a RT agitando delicatamente. Rimuovere il 1X PBS e correzione con 200 μL di paraformaldeide al 4% per 30 min a RT agitando delicatamente. Assicurarsi che il gel “matrix” appare chiaro dopo questo passaggio.Nota: Sono possibili anche metanolo o formalina fissazione. Metodo di fissazione deve essere ottimizzato per gli anticorpi specifici come certi metodi di fissazione possono crosslink gli antigeni di interesse o placare fluorescenti-etichettatura-proteine di interesse. Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente.Nota: La lunghezza delle fasi di lavaggio deve essere ottimizzata in base alla taglia organoid. Cinque minuti è un punto di partenza sufficiente, ma la fase di lavaggio può essere allungata come necessario. Placare la autofluorescenza con 200 μL di 50mm NH4Cl in 1X PBS per 30 min a RT agitando delicatamente.Nota: Questo passaggio sarà placare autofluorescence da detriti nel lume della organoid e dall’espressione della proteina fluorescente (ad esempio di GFP) che può presentare da disegno sperimentale. Dovrebbe essere inclusa se desidera utilizzare un fluoroforo nel canale 488 ma possono essere ignorato se si desidera conservare segnale GFP. NH4Cl di rimuovere e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Permeabilize organoids in 200 μL di 0,1% detergente non ionico-100 in PBS 1X per 30 min a RT agitando delicatamente. Rimuovere il detersivo-100 non ionici 0.1% in 1X PBS e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Bloccare con 5% NHS con 200 μL di 0,1% detergente non ionico X-100 in PBS e incubare per 60 min a RT agitando delicatamente. Rimuovere il tampone bloccante e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Diluire l’anticorpo 1° in 1% BSA con 0.3% Triton X-100 in PBS 1X e aggiungere 200 μL della diapositiva camera, quindi incubare per 1-3 giorni a 4 ° C. Rimuovere l’anticorpo di 1° e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Diluire l’anticorpo 2° in 1% BSA con 0.3% Triton X-100 in PBS 1X e aggiungere 200 μL della diapositiva camera, quindi incubare per 1-3 giorni a 4 ° C al buio.Nota: La lunghezza dei tempi di incubazione dovrebbe essere ottimizzata per l’anticorpo e dimensione organoid. Alcuni richiederanno più tempo per penetrare attraverso la organoid. Concentrazione di anticorpi dovrà anche essere ottimizzato. In generale, 2 x la concentrazione usata per le sezioni FFPE è appropriata per gli anticorpi 1° e la stessa concentrazione per sezioni FFPE è appropriata per gli anticorpi di 2°. Rimuovere l’anticorpo di 2° e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Colorante di contrasto l’actina con falloidina ed il nucleo con DAPI o Hoescht, diluito secondo le raccomandazioni del produttore in 1% BSA con 0.3% Triton-X in PBS 1X. Aggiungere 200 μL a camera diapositiva, quindi incubare a + RT 40 min al buio. Montare in 200 μL di fresco 1X PBS o mezzi di montaggio ed immagine immediatamente (fluorescenza deve essere conservato per fino a 5 giorni, se non di più). Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3.Nota: Sodio azide può essere aggiunto ai campioni per prevenire la contaminazione se imaging confocale non è prontamente disponibile. Aggiunta di un agente di compensazione può migliorare la formazione immagine. 7. intero-montaggio dei Organoids per saggi e sonde fluorescenti Nota: Ci sono commercialmente disponibili saggi e sonde fluorescenti (esempi sono inclusi nell’elenco materiali) modificabili per l’utilizzo su organoids montato insieme ad osservare una varietà di utili endpoint19. Il seguente protocollo è per il kit di proliferazione di EdU fluorescente etichettati, tuttavia qualsiasi kit può essere modificato per l’utilizzo con un campione di tutto-montato. 50 μL di media di rimuovere con cautela e sostituire con 50 μL di 20 μM 2 x EdU soluzione di lavoro pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra media e matrice di gel. Incubare a 4 ° C per 1-3 giorni (il periodo desiderato per l’incorporazione di EdU dovrebbe essere ottimizzato per tipo di cella di scelta). Seguire i passaggi 6.2 – 6,8 per trasferire il organoids di interesse su una diapositiva di camera o piatto confocale. Rimuovere PBS e difficoltà con 200 μL di 3,7% paraformaldeide per 30 min a RT agitando delicatamente. Assicurarsi che la matrice gel appaiono chiare dopo questo passaggio. Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 μL di PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Rimuovere PBS e aggiungere 200 μL di 0,5% detergente non ionico-100 in PBS 1X per 30 min a RT agitando delicatamente. Preparare un 1x fluorescente reazione cocktail secondo le specifiche del produttore. 0,5% detergente non ionico-100 di rimuovere e lavare due volte con 200 μL di 3% BSA in PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Aggiungere cocktail di reazione ed incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. Rimuovere la reazione fluorescente cocktail e lavare una volta con 200 μL di 3% BSA in PBS 1X per 5 minuti agitando delicatamente. Colorante di contrasto e Monte seguendo i passaggi 6.21 – 6,22 (Figura 3D).