JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Published: March 14, 2019
doi:
10.3791/59038
, ,
1Department of Biochemistry,Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology,Purdue University, 3Center for Plant Biology,Purdue University

Summary

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Abstract

Proteinler biyolojik sistemleri Birincil operatörler, ve genellikle diğer makro veya onların biyolojik iþlevlerini küçük moleküller ile etkileşim. Bu tür etkileşimler son derece dinamik, etkileşen alt birimleri sürekli ilişkili ve belirli oranlarda ayrışmış anlamı olabilir. Nicel açılan bağlama Kinetik eğitim etkileşimin gücünü ortaya çıkarır gibi teknikleri kullanarak bağlama benzeşme ölçme anlayışlar üzerinde nasıl hızlı sağlarken etkileşim oluşur ve ne kadar her karmaşık bulunabilir. Ayrıca, bir etkileşim bir protein Döviz Çarpanı veya bir ilaç gibi ek bir faktör huzurunda Kinetik ölçme hangi etkileşim için önemli bilgi sağlayan diğer bir faktör tarafından düzenlenmiş mekanizması ortaya çıkarmak yardımcı olur biyolojik ve tıbbi araştırma ilerlemesi. Burada, biz yüksek iç Derneği oranına sahip ve hızlı bir şekilde başka bir protein tarafından ayrışmış bir protein kompleksi bağlama Kinetik ölçmek için bir iletişim kuralı tanımlamak. Protein kompleksi tüp bebek oluşumu raporlamak için Floresans rezonans enerji transferi yöntemi kullanır ve hızlı Derneği ve gerçek zamanlı olarak durdu-akış fluorimeter kompleks ayrılma izleme sağlar. Bu tahlil kullanarak, protein kompleksi Derneği ve ayrılma hızı sabitler sayısal.

Introduction

Biyolojik etkinlikler sonuçta proteinler, en hangisinin uygun biyolojik fonksiyonlar için başkalarıyla etkileşim tarafından yapılmaktadır. Hesaplamalı bir yaklaşım kullanarak, insan protein-protein etkileşimler toplam miktarı ~ 650.0001olduğu tahmin edilmektedir ve bozulma bu etkileşimlerin kez hastalıklar2‘ ye yol açar. Hücresel ve organizma işlemlerin denetlenmesinde önemli rolleri nedeniyle, Maya-iki-hibrid, bimolecular floresan uluslara, Böl-luciferase gibi protein-protein etkileşimleri çalışmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir uluslara ve co-immunoprecipitation tahlil3. Bu yöntemler keşfetmek ve protein-protein etkileşimleri onaylayarak, iyi olmakla birlikte, genellikle sigara nicel ve böylece etkileşen protein ortakları arasında benzeşme hakkında sınırlı bilgi sağlar. Nicel çekme-çıkışlar bağlama benzeşim (örneğin, ayrışma sabiti Kd) ölçmek için kullanılabilir ama bağlama Kinetik ölçmek değil, ne de Kd bir yetersiz nedeniyle çok düşük olduğunda uygulanabilir Sinyal-gürültü oranı4. Yüzey plasmon rezonans (SPR) spektroskopisi bağlama Kinetik quantifies ama bir belirli yüzey ve potansiyel olarak reaksiyona5bağlama özelliğini değiştirebilirsiniz yüzeyi bir reaksiyona immobilizasyon gerektirir. Ayrıca, SPR hızlı Derneği ve ayrılma oranları5ölçmek zor ve SPR bir protein kompleksi protein alt alışverişi olay karakterize etmek için kullanmak için uygun değildir. Burada, protein karmaşık montaj ve demontaj, bir milisaniye zaman ölçeği oranları ölçme sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem F-box protein Satım faktörü6,7 Cullin – ssociated –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1)rolünü belirlemek için gerekliydi.

Cand1 Cullin-RING Ubikuitin ligazlar büyük ailesine ait Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligazlar dinamikleri düzenlemektedir. Yüzük etki alanı proteini Rbx1 bağlar, Cul1 ve yüzeylerde acemi ve Cul1 adaptör protein Skp18ile bağlar değiştirilebilir bir F-box protein, cullin ve SCFs oluşur. Bir E3 ligaz olarak SCF Ubikuitin, substrat için konjugasyon tromboksan ve ne zaman belgili tanımlık substrate F-box protein tarafından oluşturulmuştur ve Cul1 gibi Ubikuitin protein Nedd89tarafından değiştirildiğinde etkinleştirilir. Cand1 değiştirilmemiş Cul1 bağlar ve bağlayıcı, hem Skp1•F-box protein Cul1 ile dernek ve Nedd8 fiil Cul110,11,12,13bozan. Sonuç olarak, Cand1 bir inhibitörü SCF faaliyet tüp bebek olduğu ortaya çıktı, ama Cand1 eksikliği organizmalarda in vivo14,15,16 SCF faaliyetleri düzenleyen Cand1 olumlu bir rol göstermektedir kusur neden , 17. Bu paradoksun sonunda Cul1, Cand1 ve Skp1•F-box protein arasındaki dinamik etkileşimler ortaya bir nicel araştırma tarafından açıklandı. SCF ve Cul1•Cand1 komplekslerinin oluşumu tespit Floresans rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri kullanarak, dernek ve ayrılma oranı sabitleri (kTarih ve kkapalı, sırasıyla) olduğunu tek tek ölçülür. Cand1 ve Skp1•F-box protein formu son derece sıkı kompleks Cul1, ama kkapalı SCF ile Cand1 tarafından önemli ölçüde artar ve kkapalı Cul1•Cand1 önemli ölçüde artırılır ölçümleri ortaya tarafından Skp1•F-box protein6,7. Bu sonuçlar Cul1 eski SCF kompleksleri geri dönüşüm yoluyla yeni SCF kompleksleri tromboksan protein Satım faktör olarak Cand1 rolü tanımlamak için ilk ve kritik destek sağlar.

Burada, biz geliştirme ve Cul1•Cand1 karmaşık7dinamiklerini incelemek için FRET tahlil kullanma prosedürü mevcut ve çeşitli biomolecules dinamiklerini incelemek için aynı prensip uygulanabilir. FRET oluşur uygun dalga boyu ile heyecan verici ve bir alıcısı donör emisyon spektrum örtüşen uyarma spektrum ile 10-100 bir mesafe içinde varsa Å. Heyecan durumu böylece donör yoğunluğu azalan ve artan alıcısı yoğunluğu18alıcısı için aktarılır. PERDE (E) verimliliğini Förster RADIUS (R0) ve donör ve alıcısı fluorophores (r) arasındaki mesafe bağlıdır ve tanımı: E = R06/ (R0 6 + r6) Donör-alıcısı çifti ve çözüm spektral çakışma19kullanılan, Förster RADIUS (R0) dipol açısal yönlendirme gibi birkaç etkene bağlıdır. Donör emisyon gerçek zamanlı olarak değişiklik izler ve hızlı kTarih ve kkapalı, bir durdu-akış fluorimeter perde tahlil uygulamak için verimli FRET kurmak gereklidir bu donör emisyon önemli bir azalma sonuçlarında. Bu nedenle, boyalar takmak için uygun çift floresan boyalar ve hedef proteinler sitelerinde seçerek verimli perde tasarımı önemlidir ve bu protokol için ele alınacak.

Protocol

1. tasarım perde tahlil. Cul1•Cand1 karmaşık yapısı dosyayı Protein veri bankasından (dosya 1U6G) yükleyin. Cul1•Cand1 PyMOL içinde karmaşık yapısını görüntüleyin. Cand1 ilk amino asit ve Cul1 son amino asit arasındaki uzaklık PyMOL Sihirbazı menüsünden Ölçüm işlevini kullanın (şekil 1). Online spectra Görüntüleyici yükler ( Tablo malzemelerigörmek) ve uyarma ve emi…

Representative Results

PERDE arasında Cul1 test etmek içinAMC ve FlAsHCand1, biz ilk 70 emisyon yoğunluğu tespit nM Cul1AMC (donör) ve 70 nM FlAsHCand1 (alıcısı), sırasıyla (şekil 3A-C, mavi çizgiler). Sadece bugünü ve FlAsHCand1 emisyon bir emisyon zirve oldu her analizde, (alıcısı) düşük. 70 zaman her Cul1 nM FRET oluşturmak için karışıkAMC ve FlAsHCand1, iki emi…

Discussion

PERDE eğitim ve biyolojik sistemleri19anlamak için büyük ilgi olduğunu fiziksel bir olgudur. Burada, test etme ve iki etkileşen protein bağlayıcı Kinetik çalışmaya FRET kullanma için bir iletişim kuralı mevcut. PERDE tasarımı yaparken, biz üç önemli faktörler olarak kabul: donör emisyon ve alıcısı uyarma, iki fluorophores ve fluorophores28dipol yönünü arasındaki mesafe arasında spektral örtüşme. Fluorophores perde için seçmek için uyarma …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Shu-Ou Shan (Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü) perde tahlil gelişimi üzerinde anlayışlı tartışma için teşekkür ediyoruz. M.G., Y.Z. ve X.L. Y.Z. Purdue Üniversitesi’nden başlangıç fonlar tarafından finanse edilmiştir ve X.L.This iş kısmen bitki Biyoloji için Purdue Üniversitesi Merkezi bir tohum hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Anion exchange chromatography column GE Healthcare 17505301 HiTrap Q FF anion exchange chromatography column
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf 2231000511
BL21 (DE3) Competent Cells ThermoFisher Scientific C600003
Calcium Chloride Fisher Scientific C78-500
Cation exchange chromatography column GE Healthcare 17505401 HiTrap SP Sepharose FF
Desalting Column GE Healthcare 17085101
Floor model centrifuge (high speed) Beckman Coulter J2-MC
Floor model centrifuge (low speed) Beckman Coulter J6-MI
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax fluorimeter HORIBA FluoroMax-3
FPLC GE Healthcare 29018224
GGGGAMC peptide New England Peptide custom synthesis
Glutathione beads GE Healthcare 17075605
Glycerol Fisher Scientific G33-500
HEPES Fisher Scientific BP310-100
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Fisher Scientific 15-529-019
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Ovalbumin MilliporeSigma A2512
pGEX-4T-2 vector GE Healthcare 28954550
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma 4693132001
Reduced glutathione Fisher Scientific BP25211
Refrigerated shaker Eppendorf M1282-0004
Rosetta Competent Cells MilliporeSigma 70953-3
Size exclusion chromatography column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 10/300 GL column
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Stopped-flow fluorimeter Hi-Tech Scientific SF-61 DX2
TCEP·HCl Fisher Scientific PI20490
Thrombin MilliporeSigma T4648
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Ultrafiltration membrane MilliporeSigma UFC903008 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
  2. Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
  3. Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
  4. Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
  5. Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
  6. Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
  7. Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
  8. Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
  9. Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
  10. Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
  11. Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
  12. Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
  13. Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
  14. Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
  15. Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
  16. Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
  17. Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
  18. Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
  19. Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
  20. Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
  21. Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
  22. Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  24. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
  26. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
  27. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
  28. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
  29. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  30. Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
  31. Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
  32. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  33. Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
  34. Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
  35. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
  36. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
  37. Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  38. Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
  39. Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).

Tags

FRETProtein ComplexKineticsAssociationDissociationCOL1CAND17-amino-4-methylcoumarinFlASHCell LysisSonicationCentrifugationGlutathione BeadsElutionThrombinBuffer A

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Garsamo, M., Zhou, Y., Liu, X. Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale. J. Vis. Exp. (145), e59038, doi:10.3791/59038 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image