多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別
Summary
このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2 生物のユニークな側面を活用しています。
Abstract
キナーゼ基質の関係の研究は生理と病態におけるこれらの酵素とその下流の機能の完全な理解を得るために不可欠です。CK2 は複数の細胞プロセスに関与する基板の何百もの成長のリストに進化上保存されたセリン/スレオニン キナーゼです。その多面プロパティのため抽出と定量化 CK2 基板の包括的なセットは特に挑戦されているし、この重要な酵素の研究でハードルのまま。このような課題に対処するため、我々 は、ターゲットの濃縮と推定 CK2 基板の識別を可能にする汎用性の高い実験的戦略を考案した.このプロトコルは、ライセートその基質細胞または組織の特定の thiophosphorylation を可能にする CK2 のユニークな二重共同基質特異性の活用します。これらの基質タンパク質がその後は、アルキル化、沈澱と液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法 (MS/LCMS) によって識別されます。我々 はショウジョウバエ卵巣から CK2 基板を正しく識別するこのアプローチを使用している以前とここで我々 は調査方法の適応性を示すひと膠芽腫細胞にこのプロトコルのアプリケーションを拡張、各種のモデル生物・実験システムにおけるこのキナーゼの生物学的役割は。
Introduction
蛋白質キナーゼはシグナル伝達カスケードの主要なコンポーネントです。これらの酵素による基質タンパク質のリン酸化は細胞分裂、新陳代謝および他の中の分化を制御する重要なイベントを調節する生体反応を引き出します。CK2 は普遍的表現、好酸性セリン/スレオニン ・ キナーゼ人間に酵母から保存されているが、転写制御からアポトーシス1 細胞周期の進行に至るまで多くの細胞プロセスで重要な役割を果たしています。、2,3。酵素は 2 つの触媒 α で構成される heterotetramer (または α’) サブユニットと 2 つの規制 β サブユニット4。高い, だけでなく、CK2 の特徴 2 他珍しいその分析を複雑にするすなわち、構成活動5と二重共同の基質特異性6。この後者のプロパティは、基質タンパク質のリン酸化のため ATP と同様に GTP を使用する能力を持つ CK2 を与えます。
マウス CK2 の触媒作用または規制のサブユニットの遺伝子の欠失は、開発と器官形成7、8時に重要な役割を果たしていることを示す胚性致死の結果します。CK2 は癌のいくつかの種類の過剰発現も、従って有望な治療上のターゲット9,10,11を表します。確かに、特異的阻害剤そのターゲット CK2 キナーゼ活動現在調査中ですこの目的12,13,14。一方、CK2 の阻害は, 本来の代わりを与え、可能なオプションと、おそらくより合理的なアプローチはある特定の癌の進行の根底にある重要な CK2 基板を対象とするでしょう。したがって、包括的な同定と CK2 基質タンパク質の機能解析は特定の組織や腫瘍の型の中でこのキナーゼの特定の機能を解明するための重要な利点のでしょう。
ここでは、細胞や組織ライセートなど複雑な生体試料から CK2 基板を識別するため多彩な生化学的手法について述べる。このプロトコルを用いて GTP アナログ GTPγS (その他の内因性のキナーゼを使用ことはできませんグアノシン 5′-[γ-thio]triphosphate) CK2 のデュアルの共同の基質特異性の活用します。これにより、このサンプルに後続の分離と同定のための基板を「ラベル」としてキナーゼ。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、複雑な生物的サンプルからの蛋白質キナーゼ CK2 の基板を識別するため比較的単純な生化学的手法について述べる。このプロトコルの重要なステップは、CK2 の異常な酵素学的性質に基づくし、CK2 依存 thiophosphorylation GTPγS 以降免疫沈降と識別を用いた特異的基質タンパク質が含まれています。これらの結果、ひと神経膠芽腫細胞、ショウジョウバエ卵巣18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、授業を実施するペンシルベニア州保健省から連邦普遍的な研究強化助成金によって部分で支えられました
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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