Cell fraktionering av U937 celler i avsaknad av höghastighetståg centrifugering

Tillförlitlig identifiering av protein lokalisering är ofta nödvändigt när man undersöker molekylära vägar i eukaryota celler. Metoder för att erhålla subcellulär fraktioner utnyttjas av forskare att närmare undersöka cellulära komponenter av intresse.

Majoriteten av befintlig cell fraktionering metoder generellt faller i två breda kategorier, diskmedel-baserade^1,2 och ultracentrifugering-baserade^3,4,5, som kan vara olika hastighet, precision och kostnad. Rengöringsmedel baserat protokoll är beroende av användningen av buffertar med ökande tvättmedel styrka för att solubilize olika komponenter av cellen. Detta är en snabb och bekväm metod för bearbetning av prover och kan vara kostnadseffektivt om antal och storlek av prover är små. Diskmedel-baserade Kit kan köpas för att isolera cytoplasmiska, membran/organell (blandad fraktion) och nukleära fraktioner från celler. Men begränsa flera nackdelar är associerad med dessa kit deras användbarhet för forskare. De är utformade för att enkelt isolera en eller två beståndsdelar i cellen, men är oförmögna att isolera alla fraktioner från ett prov samtidigt. Användningen av rengöringsmedel innebär att plasma membranet och membran slutna organeller kommer vara lika solubilized och därför inte kan skiljas från varandra. En ytterligare komplikation uppstår från de egenutvecklade komponenterna i dessa kit som förhindrar forskare från att ändra villkoren för specifika applikationer. Slutligen de är begränsade i antalet användningar och kan vara oöverkomligt dyrt för större skala experiment. Icke-tvättmedel baserat kit finns för isolering av mitokondrier, men de är inte avsedda att isolera plasmamembranet och prov avkastningen är betydligt mindre än det från densitet centrifugering baserat isolering protokoll^6,7 .

Metoder som utnyttjar ultracentrifugering Erhåll fraktioner är mer tidskrävande, men ofta resulterar i renare fraktioner än diskmedel-baserade kit. För att isolera plasma membran från celler utan första solubilizing dem (resulterar i förorening med membran organeller) kräver dem att vara lyserat av en icke-tvättmedel metod följt av separation av cellulära komponenter via differential centrifugering — med plasmamembranet isolering som kräver hastigheter på 100 000 × g att utföra. I många fall måste differentiell centrifugering följas av isopycnic täthet lutning centrifugering för ytterligare separation av cellulära fraktioner eller avlägsnande av föroreningar. Medan dessa metoder är grundlig och modifierbara, inkluderar nackdelarna kostnad, tidsförbrukning och behovet av en ultracentrifugen för separation av bråk och ytterligare rening via täthet lutning centrifugering. De flesta höghastighetståg centrifuger är en kostnad som är oöverkomliga för enskilda utredare och ofta delade, core utrustning vid akademiska institutioner. Således blir ultracentrifugen tillgänglighet oöverkomliga i dessa situationer.

I detta fraktionering protokoll visar vi isolering av subcellulär fraktioner utan användning av solubilizing rengöringsmedel och hög hastighet centrifugering. Denna metod gör att forskare att isolera de plasmamembran, mitokondrier och cytoplasmiska komponenterna i en eukaryot cell med minimal nedsmutsning mellan fraktioner.