Här presenterar vi ett protokoll för att isolera plasmamembran, cytoplasman och mitokondrierna av U937 celler utan användning av höghastighetståg centrifugering. Denna teknik kan användas för att rena subcellulär fraktioner för efterföljande prövning av protein lokalisering via immunoblotting.
I detta protokoll detalj vi en metod för att erhålla subcellulär fraktioner av U937 celler utan användning av ultracentrifugering eller urskillningslösa rengöringsmedel. Denna metod använder hypoton buffertar, digitonin, mekaniska lysis och differentiell centrifugering att isolera cytoplasman, mitokondrier och plasmamembranet. Processen kan skalas för att tillgodose behoven hos forskare, är billig och enkel. Denna metod gör att forskare att bestämma protein lokalisering i celler utan specialiserade centrifuger och utan användning av kommersiella kit, som båda kan vara oöverkomligt kostsamma. Vi har framgångsrikt använt denna metod att separera cytosoliska, plasmamembranet och mitokondrie proteiner i mänskliga monocyt cell linje U937.
Tillförlitlig identifiering av protein lokalisering är ofta nödvändigt när man undersöker molekylära vägar i eukaryota celler. Metoder för att erhålla subcellulär fraktioner utnyttjas av forskare att närmare undersöka cellulära komponenter av intresse.
Majoriteten av befintlig cell fraktionering metoder generellt faller i två breda kategorier, diskmedel-baserade1,2 och ultracentrifugering-baserade3,4,5, som kan vara olika hastighet, precision och kostnad. Rengöringsmedel baserat protokoll är beroende av användningen av buffertar med ökande tvättmedel styrka för att solubilize olika komponenter av cellen. Detta är en snabb och bekväm metod för bearbetning av prover och kan vara kostnadseffektivt om antal och storlek av prover är små. Diskmedel-baserade Kit kan köpas för att isolera cytoplasmiska, membran/organell (blandad fraktion) och nukleära fraktioner från celler. Men begränsa flera nackdelar är associerad med dessa kit deras användbarhet för forskare. De är utformade för att enkelt isolera en eller två beståndsdelar i cellen, men är oförmögna att isolera alla fraktioner från ett prov samtidigt. Användningen av rengöringsmedel innebär att plasma membranet och membran slutna organeller kommer vara lika solubilized och därför inte kan skiljas från varandra. En ytterligare komplikation uppstår från de egenutvecklade komponenterna i dessa kit som förhindrar forskare från att ändra villkoren för specifika applikationer. Slutligen de är begränsade i antalet användningar och kan vara oöverkomligt dyrt för större skala experiment. Icke-tvättmedel baserat kit finns för isolering av mitokondrier, men de är inte avsedda att isolera plasmamembranet och prov avkastningen är betydligt mindre än det från densitet centrifugering baserat isolering protokoll6,7 .
Metoder som utnyttjar ultracentrifugering Erhåll fraktioner är mer tidskrävande, men ofta resulterar i renare fraktioner än diskmedel-baserade kit. För att isolera plasma membran från celler utan första solubilizing dem (resulterar i förorening med membran organeller) kräver dem att vara lyserat av en icke-tvättmedel metod följt av separation av cellulära komponenter via differential centrifugering — med plasmamembranet isolering som kräver hastigheter på 100 000 × g att utföra. I många fall måste differentiell centrifugering följas av isopycnic täthet lutning centrifugering för ytterligare separation av cellulära fraktioner eller avlägsnande av föroreningar. Medan dessa metoder är grundlig och modifierbara, inkluderar nackdelarna kostnad, tidsförbrukning och behovet av en ultracentrifugen för separation av bråk och ytterligare rening via täthet lutning centrifugering. De flesta höghastighetståg centrifuger är en kostnad som är oöverkomliga för enskilda utredare och ofta delade, core utrustning vid akademiska institutioner. Således blir ultracentrifugen tillgänglighet oöverkomliga i dessa situationer.
I detta fraktionering protokoll visar vi isolering av subcellulär fraktioner utan användning av solubilizing rengöringsmedel och hög hastighet centrifugering. Denna metod gör att forskare att isolera de plasmamembran, mitokondrier och cytoplasmiska komponenterna i en eukaryot cell med minimal nedsmutsning mellan fraktioner.
Utvecklingen av detta protokoll uppstod från en oförmåga att skilja mitokondrie och membran prover, med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit, för analys av protein localization under necroptosis14. De primära begränsningarna av premade kit är deras oförmåga att anpassas till behoven hos enskilda forskare, deras kostnad per prov och begränsat antal prov kunna bearbetas. Metoden presenteras här kan utföras utan användning av dyra reagenser och utan behovet av dyrbar utrustning. Denn…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av NIH-1R15HL135675-01 till Timothy J. LaRocca
Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |