Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at isolere plasma membran, cytoplasma og mitokondrier af U937 celler uden brug af højhastighedstog centrifugering. Denne teknik kan bruges til at rense subcellulært brøker for efterfølgende undersøgelse af protein lokalisering via immunoblotting.
Abstract
I denne protokol detaljer vi en metode til at opnå subcellulært brøkdele af U937 celler uden brug af ultracentrifugering eller vilkårlige rengøringsmidler. Denne metode udnytter hypotonic buffere, digitonin, mekaniske lysis og differentieret centrifugering at isolere cytoplasma, mitokondrier og plasma membran. Processen kan skaleres til at imødekomme behovene hos forskere, er billig og ligetil. Denne metode giver forskere til at bestemme protein lokalisering i celler uden specialiserede centrifuger og uden brug af kommercielle kits, som begge kan være uoverkommeligt dyre. Vi har med succes brugt denne metode til at adskille cytosole, plasma membran og mitokondrielle proteiner i humane monocyt cellelinie U937.
Introduction
Pålidelig identifikation af protein lokalisering er ofte nødvendig, når undersøge molekylære veje i eukaryote celler. Metoder til at opnå subcellulært fraktioner er udnyttet af forskere mere nøje undersøge cellulære komponenter af interesse.
Fleste af eksisterende celle fraktionering metoder generelt falder i to hovedkategorier, vaskemiddel-baseret1,2 og ultracentrifugering-baserede3,4,5, som kan være differentieret hastighed, præcision og pris. Vaskemiddel baseret protokoller er afhængige af brugen af buffere med vaskemiddel styrke for at solubilize forskellige komponenter i cellen. Dette er en hurtig og bekvem metode til behandling af prøver og kan være omkostningseffektive, hvis antal og størrelse af prøver er små. Vaskemiddel-baseret kits kan købes for at isolere cytoplasmatisk, membran/organelle (blandet brøkdel) og nukleare fraktioner fra celler. Dog begrænser flere ulemper forbundet med disse kits deres anvendelighed til forskere. De er designet til let isolere en eller to komponenter i cellen, men er stand til at isolere alle fraktioner fra en stikprøve samtidigt. Brugen af detergenter betyder, at plasma membran og membran-lukkede organeller vil være lige så solubilized og derfor ikke kan adskilles fra hinanden. En yderligere komplikation opstår fra de proprietære komponenter i disse kits, der forhindrer forskerne i at ændre betingelserne for specifikke applikationer. Endelig, de er begrænset i antal anvendelser og kan være uoverkommeligt dyre for større skala eksperimenter. Ikke-rengøringsmiddel baseret kits findes til isolering af mitochondrier, men de er ikke designet til at isolere plasma membran og prøve udbytte er betydeligt mindre end det fra tæthed centrifugering baseret isolation protokoller6,7 .
Metoder, der udnytter ultracentrifugering for at få fraktioner er mere tidskrævende, men ofte resultere i renere fraktioner end vaskemiddel-baseret kits. For at isolere plasma membraner fra celler uden første solubilizing dem (hvilket resulterer i forurening med membran organeller) kræver dem til at være mængden af en ikke-rengøringsmiddel metode efterfulgt af adskillelse af cellulære komponenter via differentieret centrifugering — med plasma membran isolation kræver hastigheder på 100.000 × g at udrette. I mange tilfælde skal differential centrifugering efterfulgt af isopycnic tæthed gradient centrifugering for yderligere adskillelse af cellulære brøker eller fjernelse af forurenende stoffer. Mens disse metoder er grundig og modificerbare, omfatter ulemper omkostninger, tidsforbrug og behovet for en ultracentrifuge til adskillelse af brøker og yderligere rensning via tæthed gradient centrifugering. De fleste Højhastighedscentrifuger er til en pris, der er uoverkommelige for enkelte undersøgelsesmedarbejdere og ofte delt, core udstyr på akademiske institutioner. Således bliver ultracentrifuge tilgængelighed uoverkommelige i disse situationer.
I protokollens fraktionering vise vi isolering af subcellulært brøker uden brug af solubilizing rengøringsmidler og uden hurtig centrifugering. Denne metode giver forskere at isolere plasma membran, mitokondrier og cytoplasmatisk komponenter i en eukaryote celle med minimal kontaminering mellem fraktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af denne protokol skyldtes manglende evne til at adskille mitokondrie og membran prøver, ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits, analyse af protein lokalisering under necroptosis14. De primære begrænsninger af premade kits er deres evne til at være tilpasset til behovene, som enkelte forskere, deres kostpris pr. prøve og begrænset antal prøver at blive behandlet. Metoden præsenteres her kan udføres uden brug af dyrt reagenser og uden behov for dyrt udstyr. Denne metode k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet var støttet af NIH-1R15HL135675-01-Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
