高速离心条件下 u937 细胞的细胞分裂
Summary
在这里, 我们提出了一个在不使用高速离心的情况下分离 u937 细胞的质膜、细胞质和线粒体的方案。该技术可用于纯化亚细胞组分, 以便随后通过免疫印迹检查蛋白质定位。
Abstract
在该协议中, 我们详细介绍了在不使用超离心或不滥用洗涤剂的情况下获取 u937 细胞亚细胞分数的方法。该方法利用低渗缓冲液、数字素、机械裂解和差动离心分离细胞质、线粒体和质膜。这个过程可以扩大规模, 以满足研究人员的需求, 既便宜又直接。这种方法将使研究人员能够在没有专门离心机和商业试剂盒的情况下确定细胞中蛋白质的定位, 这两种方法的成本都高得令人望而却步。我们已经成功地使用这种方法分离人单细胞系 u937 中的细胞质、质膜和线粒体蛋白。
Introduction
在检查真核细胞中的分子途径时, 通常需要可靠地识别蛋白质定位。研究人员利用获得亚细胞组分的方法来更仔细地检查感兴趣的细胞成分。
大多数现有的细胞分馏方法一般分为两大类, 即基于洗涤剂的 1、2和基于超离心的3、4、5, 它们可以是以速度、精度和成本为区别。基于洗涤剂的协议依赖于使用具有不断增加的洗涤剂强度的缓冲液来溶解细胞的不同成分。这是一种快速方便的样品处理方法, 如果样品数量和大小较小, 则具有成本效益。以洗涤剂为基础的试剂盒可以从细胞中分离细胞质、膜细胞器 (混合组分) 和核组分。然而, 与这些试剂盒相关的一些缺点限制了他们对研究人员的有用性。它们旨在轻松分离单元的一个或两个组件, 但无法同时从样本中分离所有分数。洗涤剂的使用意味着质膜和膜封闭的细胞器将同样溶解, 因此, 无法相互分离。另一个复杂因素来自于这些试剂盒中的专有组件, 这些组件阻止研究人员更改特定应用的条件。最后, 它们的用途有限, 对于规模较大的实验来说可能费用高得令人望而却步。非洗涤剂为基础的试剂盒存在于线粒体的分离, 但是, 它们不是用来分离质膜的, 样品的收率明显低于密度离心分离协议6,7.
利用超离心获得分数的方法比基于洗涤剂的试剂盒更耗时, 但往往会产生更纯净的组分。要在不首先溶解细胞的情况下从细胞中分离等离子体膜 (导致膜细胞器污染), 需要用非洗涤剂方法对其进行裂解, 然后通过差异分离细胞成分离心–质膜分离需要 100, 000xg 的速度才能完成。在许多情况下, 差动离心之后必须进行等温密度梯度离心, 以进一步分离细胞组分或去除污染物。虽然这些方法是彻底和可修改的, 缺点包括成本, 时间消耗, 以及需要一个超离心分离的分数和进一步纯化通过密度梯度离心。大多数高速离心机的费用对个别调查人员来说是令人望而却步的, 而且往往是学术机构共享的核心设备。因此, 在这些情况下, 超离心机的可用性变得令人望而却步。
在这个分馏协议中, 我们证明了在不使用溶解性洗涤剂和不高速离心的情况下分离亚细胞分数。这种方法将使研究人员能够分离真核细胞的质膜、线粒体和细胞质成分, 并将分数之间的污染降至最低。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方案的发展源于无法分离线粒体和膜样本, 使用商业上可获得的试剂盒, 以分析在坏死14期间的蛋白质定位.预制试剂盒的主要局限性是, 它们无法适应个别研究人员的需要, 每个样本的费用有限, 能够加工的样品数量有限。这里介绍的方法可以在不使用昂贵的试剂的情况下进行, 也不需要昂贵的设备。这种方法可以进行缩放, 以容纳任意数量的细胞, 并能够进行修改, 以适应研究人?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nih-1r15hl13565-01 为 timothy j. lrocca 提供了支持
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
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