정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩
Summary
간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Abstract
항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.
Introduction
임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftriaxone 및 azithromycin9,10, 함께 무 증상 감염의 증가 실패 임 질 치료 실패를 이해 하기 위한 필요를 강조 한다.
한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 최소 억제 농도 (MIC) 테스트는 항생제에 저항을 식별에 대 한 표준 의학 시험으로 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마이크 테스트 세균성 항 생 저항 vivo에서 반영 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 항생제의 살 균 농도의 박테리아의 생존에 기여 하는 박테리아 biofilms의 형성: 마이크 테스트 하는 것은이 효과11을 감지할 수. GC는12점 막 표면 biofilms을 형성할 수 있다, 때문에 우리가 가설 그 항생제 자화 율 집계 내 개별 GC에서 본 다른 것. 또한, 연구 3 상 가변 표면 분자, Pili, 불투명도 관련 단백질 (Opa), 및 lipooligosaccharides (로스), 규제 간 박테리아 상호 작용, 다른 크기의 집계13, 으로 이어질 14 , 15. 항생제 저항에 이러한 구성의 기여 적절 한 방법의 부족으로 검사 하지.
현재, biofilm 박멸을 측정 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 가장 널리 사용 되는 양적 방법 크리스탈 바이올렛16얼룩을 사용 하 여 바이오 매스의 변화를 측정 하는 것입니다. 그러나, 방법 중요 한 실험적인 조작 실험 반복17에서 잠재적으로 오류를 생성할 수 있는 필요 합니다. 여기에 사용 되는 라이브/죽은 착 방법 라이브 하 고 죽은 박테리아와 그들의 분포는 biofilm 내의 시각화 수 있습니다. 그러나, biofilm 구조의 염료 침투를 감소 시키는 물리적 장벽으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 그룹 내에서 라이브/죽은 박테리아를 계량 하는 얼룩 작은 biofilms 또는 그것의 선구자-microcolonies 또는 집계로 제한 됩니다. 다른 방법을, 한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 집단의 효과 측정할 수 없습니다. 것 필요 모두를 측정할 수 있는 정량적 분석 결과 박테리아 생활과 그들의 분포를 시각화 항생제 노출, 이상적인 방법 집계에서 GC 민감성을 검사 합니다.
여기에 설명 된 절차는 ATP 사용률 측정 결합 및 라이브/죽은 얼룩을 양적 분석 결과 항생제의 집계에서 GC 민감성을 시각적으로 검사.
Protocol
Representative Results
Discussion
박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 “첫 해 혁신 및 연구 경험” 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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