Élever le tétra aveugle Astyanax mexicanus pour l’analyse des phénotypes de le Post-larval et l’ensemble monture immunohistochimie
Summary
Dans ce protocole, nous montrent comment se reproduisent les adultes Astyanax mexicanus , élever les larves et effectuer ensemble monture immunohistochimie post larves de poissons pour comparer les phénotypes de surface et cave morphotypes.
Abstract
Rivière et populations adaptées grotte d’Astyanax mexicanus montrent des différences dans la morphologie, la physiologie et le comportement. Recherche axée sur la comparaison des formes adultes a révélé la base génétique de certaines de ces différences. On connaît moins comment les populations diffèrent stade post-larvaire (au début de l’alimentation). Ces études peuvent donner un aperçu comment agassizii survivre à la vie adulte dans leur environnement naturel. Méthodes permettant de comparer le développement postlarvaire en laboratoire nécessitent normalisés de l’aquaculture et des régimes alimentaires. Ici, nous décrivons comment élever des poissons sur une alimentation riche en nutriments les rotifères dans non-recirculation de l’eau pendant jusqu’à deux semaines après la fécondation. Nous démontrons comment recueillir des larves de poissons de ce système de pépinière et effectuer l’ensemble monture immunostaining. Immunomarquage est une alternative intéressante à l’analyse de l’expression transgénique pour étudier le développement et la fonction du gène chez a. mexicanus. La méthode de la pépinière utilisable également comme un protocole standard pour les populations de même densité établissant pour la croissance des adultes.
Introduction
Le tétra aveugle, Astyanax mexicanus, est d’une seule espèce de poisson qui existe sous forme de populations vivant dans la rivière (poissons de surface) et un certain nombre de populations cavernicoles (agassizii) nommé pour les grottes qu’où ils habitent (c.-à-d. – Tinaja, Molino, Pachón). Un nombre croissant de chercheurs se servent a. mexicanus pour enquêter sur les bases génétiques et du développement comportemental1,2,3,4, métabolique5,6 ,7,8et évolution morphologique9,10,11. Ressources disponibles pour l’étude d’a. mexicanus comprennent un génome séquencé et annoté12; transcriptome13; développement de table intermédiaire14; et méthodes de reproduction15,16,17, créer transgéniques18et éditer des gènes19. Diffusion des outils supplémentaires et des protocoles standard mise à jour permettra d’accélérer la croissance de la communauté de recherche agassizii (voir cette collection de méthodes20).
Notre objectif consiste à ajouter au répertoire des outils existant en fournissant une méthode fiable pour évaluer les gène activité in situ dans de post-larvaire a. mexicanus, d’une manière comparable entre laboratoires. Il y a deux défis pour atteindre cet objectif. Tout d’abord, il y a un besoin de régimes normalisés pour couver et élever le poisson entre laboratoires, comme les différences dans les paramètres tels que l’alimentation et la densité affectent la croissance et la maturation, ainsi un impact sur l’activité des gènes. Deuxièmement, il y a un besoin pour une méthode normalisée mais adaptable à l’examen des tendances de l’activité des gènes chez les poissons post-larvaire. Nous abordons ces questions ici, en établissant des pratiques normalisées pour élever des poissons à l’état larvaire et introduisant un protocole robuste ensemble monture immunohistochimie (IHC) pour évaluer l’expression génique chez a. mexicanus.
Nous démontrons d’abord comment se reproduisent les poissons par reproduction naturelle et identifier les oeufs fécondés. Suivant décrit est comment faire éclore des oeufs fécondés (larves) et les transférer aux conteneurs de pépinière, où ils sont maintenus à une densité de 20 poissons par récipient pendant deux semaines sans recirculation ou en changeant l’eau. À 5 jours après la fécondation, les poissons ont mis au point au stade post-larvaire (n’est plus avoir un approvisionnement de jaune de œuf) et reçoivent des algues nourries Brachionus plicatilis (rotifères) comme source de nourriture riche en nutriments qui ne nécessitent pas de réapprovisionnement quotidien. Cette méthode fournit des paramètres de croissance constante pour le développement larvaire et post-larvaire.
Pour évaluer la fonction des gènes, nous démontrons comment retirer le poisson de conteneurs du pépinières et effectuer l’ensemble monture IHC. La méthode IHC présentée est une adaptation de protocoles mis au point pour une utilisation avec des Danio rerio21 et est efficace pour l’examen des antigènes dans tous les tissus d’a. mexicanus testés, y compris le cerveau, intestin et le pancréas. IHC est une alternative plus rapide pour générer des animaux transgéniques pour l’examen de l’expression des gènes et la localisation des protéines. Ce protocole sera utile pour les études visant à a. mexicanus de plus en plus et en comparant les phénotypes des poissons de surface et agassizii stade post-larvaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparant l’activité des gènes entre surface et grotte a. mexicanus nécessite environnement soigneusement contrôlées et méthodes qui peuvent être répliqués à travers des laboratoires. Notre protocole pour élever a. mexicanus fournit contenu nutritionnel conforme au cours du développement post-larvaire. Suite à ce régime alimentaire, la fonction du gène peut être comparée avec confiance entre les populations qui utilisent le protocole d’immunohistochemistry robuste que nous présentons. Ici nous discutons de l’importance de cette méthode ainsi que ses limites et les futures applications.
Pour atteindre la même densité de croissance, nous avons constaté que les larves de poissons peuvent être déclenchés sans recirculation de l’eau pendant deux semaines dans des récipients de 1,5 L à un régime de rotifères. Ce protocole peut également servir pour la pisciculture sur un système de recirculation ; Toutefois, les rotifères doivent être ajoutés tous les jours pour compenser ceux perdus par l’intermédiaire de l’écoulement du réservoir. Nauplies d’artémias fraîchement éclos sont couramment utilisés comme source de nourriture en aquaculture, mais nous avons trouvé que l’utilisation des rotifères a des avantages considérables, y compris : réduit les prix, amélioration de biosécurité, nutrition cohérente et meilleure qualité de l’eau (voir ci-dessous).
Tout d’abord, le coût hebdomadaire en consommables est de 4 dollars pour les rotifères, comparées à 14 dollars pour Artemia. Concernant la biosécurité, les rotifères sont élevés en laboratoire dans des conditions contrôlées, tandis que Artemia sont prélevés dans la nature et sous réserve de variation naturelle microbienne ou pathogène sommaire23. En outre, la composition en éléments nutritifs des nauplii d’Artemia sont déterminés pour l’environnement et par conséquent incompatible. Nauplius prospèrent sur leurs propres réserves énergétiques après l’éclosion ; ils perdent rapidement valeur nutritive qu’ils développent et optimale doivent être communiquées aux poissons en quelques heures. Artemia commence à se nourrir à la maison 12 après l’éclosion, soit la première fois qu’ils pouvaient s’enrichir sur le plan nutritionnel ; Cependant, à ce stade, ils sont devenus trop grands pour 5 poissons dpf à consommer. En comparaison, rotifères nourrissent continuellement de micro-algues marines aboutissant à haute teneur en éléments nutritifs quel que soit le moment où les rotifères sont récoltées. Rotifères sont beaucoup plus petits que les nauplius de Artmeia (160 vs 400 microns), ce qui les rend plus facile pour les poissons à capturer et à avaler. Agassizii et post-larvaire poissons de surface consomme des quantités similaires, ce qui laisse supposer aucune différence de préférence ou de la capacité de capturer les rotifères10les rotifères.
Enfin, nauplii d’Artemia commencent à mourir dans l’eau douce, plusieurs heures après avoir été présenté. Nauplius non consommés décroîtra, diminution rapide de la qualité de l’eau s’ils ne sont pas supprimés manuellement. Enlever les morts Artemia est fastidieux et dangereux pour post larves de poissons qui ne sont pas beaucoup plus grand que Artemia et peuvent être accidentellement supprimé ou blessés. Les rotifères peuvent vivre indéfiniment dans les conteneurs du pépinières et fournir de la nourriture pour les poissons en permanence sans impacter significativement les qualité de l’eau.
Alors qu’à l’aide de rotifères comme une source de nourriture a des avantages considérables, pour maintenir les algues stock, rotifère doit être ajouté pour le système de culture tous les jours. Ceci peut être réalisé avec un chargeur automatique qui distribue des algues liquides dans le récipient de culture de rotifères (voir Table des matières). Les rotifères doivent également être récoltés de ce set-up toutes les 24-48 heures pour maintenir la santé de la culture. Les chercheurs qui se reproduisent les poissons très rarement (une fois par an, par exemple) et ne sont pas chargés de faire des comparaisons entre les populations à l’état larvaire peuvent préférer Artemia comme source de nourriture, étant donné que les embryons enkystés peuvent être mis à couver à tout moment.
Nous vous recommandons de suivre le nombre de larves écloses et survivants à surveiller le succès de l’éclosion et la croissance. Si la plupart des embryons ou des larves meurt, il peut être due à la contamination bactérienne ou fongique. Il est recommandé de surveiller la qualité de l’eau de l’eau prête à poissons et stériliser tout équipement avec l’éthanol à 70 %. Conteneurs du pépinières peuvent être réutilisées après que qu’ils sont nettoyés et stérilisés. Pour minimiser le risque de maladie, il est également essentiel de supprimer n’importe quel poisson mort les conteneurs du pépinières et pas ajouter des rotifères avant dpf 5, lorsque les poissons commencent à manger.
A. mexicanus sont sexuellement matures à environ un an. Il s’agit d’une limitation pour la production transgénique a. mexicanus comparée à Danio rerio (poisson zèbre) qui sont capables de se reproduire à 10-12 semaines24. L’immunohistochimie (IHC) est une méthode alternative pour étudier l’expression des gènes et la localisation des protéines. Le protocole décrit ici peut être adapté à chaque étape et pour détecter les antigènes dans n’importe quel tissu d’intérêt. Il est important de noter, toutefois, que certains tissus peuvent être plus difficiles à visualiser en poissons de surface en raison de la pigmentation (une barrière qui n’existe pas en non pigmentées agassizii), qui peuvent influer sur l’interprétation des études comparatives. Pour résoudre ce problème potentiel, pigment de poissons de surface peut être blanchi après fixation à l’aide de peroxyde d’hydrogène 3 %.
IHC nécessite la fixation du tissu réussie, blocage et la pénétration de l’anticorps. Méthodes pour chacun varient selon le tissu et la protéine d’intérêt. La fois fixateur et fixation doit préserver l’architecture cellulaire tout en conservant l’épitope d’antigène. Pour ce protocole, nous utiliser un fixateur de réticulation (paraformaldéhyde) et omettre un fixateur de dénaturation (comme le méthanol ou l’acétone). Nous avons trouvé que l’incubation dans de l’acétone diminuée signal d’anticorps pour les marqueurs neurones et pancréatiques. L’étape de blocage est indispensable pour éviter des anticorps de se lier aux protéines non visés dans les tissus. Cette méthode utilise une combinaison de sérum normal (5 %) et de la BSA (0,2 %) dans la solution de blocage. La solution de blocage contient des anticorps et des protéines qui se lient aux sites réactifs sur les protéines dans les tissus, diminuant la liaison non spécifique de l’anticorps primaires et secondaires.
Pour obtenir une pénétration anticorps, le tissu doit être perméabilisé. Ceci peut être réalisé avec des détergents ou solvants dénaturation mais doit être optimisée afin de préserver l’épitope d’antigène. Notre protocole utilise une combinaison de Triton et diméthylsulfoxyde (DMSO). Triton et DMSO sont inclus pendant les étapes de l’incubation de blocage et d’anticorps à des concentrations de 0,5 % et 1 %, respectivement. À l’aide de cette concentration, nous avons observé une coloration dans le cerveau, pancréas, intestin et muscle, suggérant qu’il est susceptible de compter pour la pénétration de tous les tissus. La taille des poissons peut-être également influencer la pénétration. Ce protocole n’a pas été testé sur les poissons qui sont supérieurs à 14 jours (environ 7 mm de longueur). Pour résoudre les problèmes de coloration, il est recommandé de modifier les étapes de pénétration de la fixation, le blocage et anticorps. Il est également important d’examiner la conservation de la séquence de l’immunogène avec la protéine a. mexicanus d’intérêt en utilisant le génome disponible25.
A. mexicanus est un excellent modèle pour analyser l’évolution que les populations de la même espèce qui ont évolué dans des environnements radicalement différents peuvent être comparées directement en laboratoire. Des protocoles standard de l’élevage, au sein et entre les laboratoires, sont essentiels à la compréhension des différences biologiques entre les poissons de surface et poulsoni. Notre article fournit une méthode pour examiner le développement et l’activité des gènes chez les poissons post-larvaire exposés aux paramètres d’une croissance constante.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
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