JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Published: January 29, 2019
doi:
10.3791/58960
, , , ,
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience,KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

Summary

Здесь мы описываем стратегии эффективной и воспроизводимые производить, титр и контроль качества пакетов аденоассоциированный вирус векторов. Это позволяет пользователю получить вектор препарат с высоким титр (≥1 x 1013 вектор геномов/мл) и высокой чистоты, готовые для использования в vitro или в естественных условиях .

Abstract

Джин средства доставки на основе аденоассоциированный вирусов (AAVs) являются популярным выбором для доставки трансгенов центральной нервной системы (ЦНС), включая приложения генной терапии. Векторы AAV-тиражирование, способных заразить деления и не деления клетки и обеспечить долгосрочные трансген выражение. Важно отметить, что некоторые серотипы, таких как недавно описан PHP. B, может крест крови мозг барьера (ГЭБ) в моделях животных, после системного доставки. Векторы AAV может быть эффективно производится в лаборатории. Однако надежных и воспроизводимых протоколов обязаны получить векторы AAV с достаточной чистоты и титр значения достаточно высоким для приложений в естественных условиях . Этот протокол описывает стратегию эффективной и воспроизводимый для производства вектора AAV, основанный на стратегии градиента очистки iodixanol. Метод очистки iodixanol подходит для получения пакетов векторы AAV высокого титра высокой чистоты, когда по сравнению с другими методами очистки. Кроме того протокол обычно быстрее, чем другие методы, описанные в настоящее время. Кроме того, количественные полимеразы цепная реакция (ПЦР)-стратегия описана для быстрого и точного определения вектор титра, а также Серебряный пятнать метод для определения чистоты пакете вектор. Наконец представитель результаты доставки генов в ЦНС, после системного администрирования AAV-PHP. B, представлены. Такие результаты должны быть возможным в всех лабораториях с использованием протоколов, описанные в этой статье.

Introduction

За последние 30 лет одичал тип AAVs разработаны для создания рекомбинантных векторы AAV, которые оказались исключительно полезными инструментами для переноса генов в ЦНС1,2,3,4, 5,6 и генной терапии подходы к болезни (в том числе утвержденных FDA и EMA терапии)4,7. Значительной степени их пригодности для использования в ЦНС происходит от их способность заразить-деления, после митотическая клетки, как правило, найти в ЦНС8. Однако векторы AAV-основе также имеют преимущество, позволяя долгосрочный выражение любого заданного терапевтических трансген4,9 заручаясь мягче иммунный ответ, по сравнению с другими вирусных векторов7, 8,10,,1112.

Основными элементами любого вектора AAV являются генома и капсид. Одичал тип AAVs одноцепочечной ДНК вирусов с геном приблизительно 5 kilobases (КБ)13(СС). Для производства рекомбинантного векторы AAV, rep и Кап генов (необходимые для репликации генома и Ассамблея вирусного капсида) будут удалены из генома одичал тип AAV и в транс, оставляя место для Кассета выражения, содержащие трансген14,15. Перевернутый терминала повтора последовательности (РМЭ) оригинальных вирусного генома являются только сохраненные элементы вектора AAV, как они необходимы для репликации и упаковка3,10,14. Векторы AAV могут быть спроектированы для повышения трансген выражение; мутации в одном РМЭ приводит к образованию петли шпильки, который позволяет эффективно поколения взаимодополняющих ДНК пряди3,7,15. Главное преимущество этой конфигурации, называют себя дополнительные (sc) генома, является, что она обходит потребность второй стренги синтеза типично в обычных жизненного цикла AAVs, значительно увеличивая скорость и уровня трансген выражение 1. Тем не менее, с использованием генома scAAV уменьшает грузоподъемность вектора примерно 2,4 КБ. Это включает в себя трансген последовательности, а также любые нормативные последовательности, например промоутеров или микроРНК привязки сайтов, ограничивать выражение для определенных ячеек типы16.

Капсид AAV определяет вектор хост взаимодействие клеток и наделяет определенной ячейки типа или ткани тропизм для AAV серотип, который также может быть использована для ограничения трансген выражение в определенных местах. Несколько AAV серотипов встречаются в природе, в то время как другие были произведены в лаборатории рекомбинантных подходов (например, PHP. B). Кроме того, некоторые capsids также даровать другие полезные характеристики, такие как возможность пересечь BBB, что приводит к доставке трансгенов на протяжении ЦНС после системного администрирования. Это было показано для AAV9, а также недавно описан PHP. B капсид17. Как следствие эти серотипов оказываются особенно актуальны для новых подходов генной терапии нейродегенеративных расстройств1,17,18.

Цель настоящего Протокола заключается в описать эффективный метод для мелкомасштабного производства векторы AAV высокий титр и чистоты. Хотя здесь представлены результаты используете PHP. B капсида и scAAV выражение кассету, протокол подходит для производства нескольких серотипов вектора AAV и конфигураций генома, позволяя максимальную гибкость экспериментальной. Однако вектор урожайность и окончательный чистоты может варьироваться в зависимости от выбранной серотипа.

Сам протокол представляет собой вариант классического tri-transfection метод для производства вирусный вектор и включает в себя использование iodixanol градиента для векторных очистки, который, по сравнению с классической использование цезия хлорид (CsCl) градиентов, был сообщил производить векторы AAV более высокой чистоты в более эффективным с точки зрения времени образом19,,2021.

Трансфекция, очищения и концентрации шаги предназначены для быть выполнена согласно надлежащей лабораторной практики (GLP) в лаборатории тканевых культур оценили работу вирусный вектор. Каждой задачи должен выполняться в соответствии с соответствующие местные и национальные законы, касающиеся вирусный вектор производства и использования. Работа должна осуществляться под капотом ламинарного потока и в стерильных условиях. Внутри векторного объекта рекомендуется носить фартук лаборатории, помимо регулярных культуры тканей лаборатории пальто. Кроме того двойной пара перчаток, а также пластиковые Бахилы, должны носить все время.

До начала производства вектор, обеспечить все необходимое оборудование и плазмид доступны. 1) pCapsid плазмиды содержит респ ген, который кодирует четыре неструктурных белки, необходимые для репликации, а именно: Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 и крышка ген, который кодирует три структурных капсульных белков, а именно VP1, VP2 и VP3. 2) pHelper плазмиды содержит гены E4, Группа E2и ва от аденовируса, способствующие AAV производства в HEK293T клетках. 3) pTransgene плазмиды содержит выражение кассеты трансген, в окружении двух РМЭ. Эти плазмиды может быть синтезированным de novo в лаборатории с помощью последовательности доступных онлайн22. Для плазмиды сделал de novoособенно те, которые содержат Роман трансгенов, последовательности требуется, чтобы убедиться в правильности трансген и РМЭ. В качестве альтернативы готовые плазмиды могут приобретаться напрямую через онлайн плазмида репозиториев. При необходимости, плазмиды может быть усилена и очищается с помощью стандартных комплектов, согласно инструкции производителя23.

Вектор титр чистоты может пагубно отразиться на способности трансдукции вектора. Для оценки качества производимых вектора поставляются дополнительные протоколы. Окончательный векторов будет полезна для исследования функции клеток ЦНС в приложениях, как in vitro и in vivo .

Protocol

Решение Состав Культура клеток и Трансфекция DMEM1 DMEM 1 x 1% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (v/v) DMEM10 DMEM 1 x 10% FBS (v/v) 1% GlutaMAX (v/v) 150 мм NaCl 4.380 г NaCl До 500 мл ультрачистая вода AAV очистки и опреснения 5 М NaCl 146.1 г NaCl До 500 мл ультрачистая вода 1 М трис-HCl (рН 8,5) 12.11 g Tris база ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 100 мл ультрачистая вода Добавление с помощью пипетки Пастера для снижения рН 8,5 HCl 1 M Буфер Lysis 15 мл 5 М NaCl 25 мл 1 М трис-HCl (рН 8,5) ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 500 мл ультрачистая вода 10 x фосфат амортизированное saline (PBS) 80 г NaCl 2 г хлористого калия ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 14.4 g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4 До 1 Л ПДводы 1 М MgCl2 20,33 g MgCl2-6 H2O До 100 мл ультрачистая вода KCl на 1 М 7.45 г хлористого калия ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 100 мл ультрачистая вода 5 x Стоковый раствор PBS магния-калия (PBS-МК) 250 мл 10 x PBS 2,5 мл MgCl 1 M2 6.25 мл хлористого калия 1 М ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Вверх к 500 мл Ultrapure воды H2O 15% Iodixanol 12,5 мл средний градиент плотности Optiprep ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 10 мл 5 М NaCl 10 мл 5 x PBS-МК 17,5 мл ультрачистая вода 25% Iodixanol 20.8 мл средний градиент плотности Optiprep ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 10 мл 5 x PBS-МК 19.2 мл ультрачистая вода 100 мкл фенола Красного 40% Iodixanol 33.3 мл средний градиент плотности Optiprep ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 10 мл 5 x PBS-МК 6.7 мл ультрачистая вода 60% Iodixanol 50 мл средний градиент плотности Optiprep ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 100 мкл фенола Красного ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Контроль чистоты Аав 10 x буфер ЭДТА (чай) ацетата Tris Tris база 44.8 g ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 11.4 мл Ледниковая укусная кислота (17, 4м) 3,7 г ЭДТА До 1 Л ультрачистая вода Гель агарозы 0.8 g перфторгексилоктан агарозы До 100 мл 1 x чай буфера Гель буфер Tris база 181.7 g ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 1.5 g SDS ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Отрегулируйте пэ-аш до 8,45 с 1 M HCl ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 500 мл ультрачистая вода Катод буфер 10 x Tris база 121.14 g ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 179,2 g Трицин ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 1% SDS (w/w) ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 1 Л ультрачистая вода Анодный буфер 10 x Tris база 242.3 g ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ До 1 Л ультрачистая вода Отрегулируйте пэ-аш до 8,9 с 1 M HCl ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Пример буфера 5 x Для 20 мл: Tris база 605 мг ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 4 g SDS ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 10 мг Serva синий G 12 г глицерина Отрегулируйте pH 6.8 с HCl 1 M, аликвота и хранить при температуре от-20 ° C ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Штабелируя гель Для 2 гелей: Акриламид 400 мкл ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 750 мкл буфера гель 1,85 мл ультрачистая вода 4 МКЛ TEMED ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 20 мкл 10% APS (v/v) ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Добавьте TEMED и 10% APS непосредственно перед заливкой геля. Используйте оба этих химических вещества под химические вытяжки. Разрешая гель Для 2 гелей: 3.32 мл акриламида ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 3.35 мл гель буфер 1.14 мл ультрачистая вода 2.12 мл 50% глицерина 6 МКЛ TEMED ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 50 мкл 10% APS (w/v) ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ Добавьте TEMED и 10% APS непосредственно перед заливкой геля. Используйте оба этих химических вещества под химические вытяжки. Вода насыщенный бутанола 10 мл н бутанола ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ 1 мл ультрачистая вода ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Обратитесь к таблице материалы для руководящих принципов, касающихся использования опасных химических веществ. Таблица 1: Состав требуемых решений. 1. Tri-transfection клеток HEK293T Примечание: Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для состава буферов и решения, используемые в протоколе.Примечание: Производительность этого раздела протокола занимает около 4 дней. Оттепель флакон клеток человеческого эмбриона почек (ГЭС) 293T на водяной бане в 37 ° C.Примечание: Используйте только клетки, которые были пассированной меньше, чем 20 x, чтобы гарантировать оптимальное трансфекции эффективности. Семя HEK293T клеток на плотности3 2 x 10-6 x 103 клеток/см2 в DMEM10 в 15 см диаметр клетки культуры блюда. Рост клеток до 70 – 80% слияния в стандартный набор при 37 ° C, с 95% влажности и 5% CO2инкубатор.Примечание: Производство одной партии векторы AAV, используя этот протокол требует 18 блюда культуры клеток (15 см в диаметре). Сочетанием ячейки 70% – 80% соответствует3 6 x 10-7 x 103 клеток/см2, поддерживается в 17 – 20 мл DMEM10 питательной среды. Подготовка polyethylenimine (PEI) / ДНК mix на коэффициент концентрации 1/3.5 (w/w). Подготовка смеси ДНК 18 блюда культуры клеток в один тюбик 50 мл конические путем смешивания 360 мкг pΔF6, 180 мкг pCapsid и 180 мкг pTransgene в 18 мл 150 мм NaCl. Распространять ДНК смесь через три 50 мл конические трубы (6 мл ДНК смесь на конической трубки). Подготовиться шесть ячейки культуры блюда в новой 50 мл Конические трубки, смешивая 840 мкг ПЭЙ ПЭЙ смесь (1 мкг/мкл) 6 мл 150 мм NaCl. Подготовить PEI/ДНК смесь, добавив 6 мл смеси Пей (подготовленных на шаге 1.4.3), по капле, в одной из конических труб, содержащий ДНК смесь (подготовленных на шаге 1.4.2) и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.Примечание: После 20 минут инкубации PEI/ДНК смесь станет немного мутной. Возьмите шесть клеток культуры блюда из инкубатора и полностью аспирационная среднего от каждой культуры блюдо в Ламинарный шкаф. Удаление следов среды путем полоскания блюда с 5 мл подогретую Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS). Обеспечивает распределение DPBS по всей поверхности, слегка наклоняя блюдо. Аккуратно аспирационная DPBS и добавьте 12 мл DMEM1 в каждое блюдо.Примечание: Избегайте отсоединение клетки путем добавления средне медленно, от пипетки размещены на краю тарелки. Смешайте PEI/ДНК, закупорить вверх и вниз по 3 x – 5. Добавьте 2 мл смеси PEI/ДНК в каждой из шести клетки культуры блюд в моде по капле, тщательно распределять его по всей поверхности. Как только смесь добавляется к каждому блюду, место блюда обратно в инкубаторе. Повторите шаги 1.4.3– 1.8 для оставшихся культуры блюд. Инкубировать transfected клеток для 5 ч при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2. Добавьте дополнительные 12 мл DMEM10 для каждой культуры блюдо без удаления существующих средних (средний объем = 25 мл). Инкубируйте transfected клеток до 72 ч после трансфекции при 37 ° C, с 95% влажности и 5% CO2. Дополнительный рисунок 1: морфология клеток ГЭС 293T визуализированы фазово-контрастной микроскопии (слева) с подтверждением выражения КГВ визуализированы флуоресценции изображений (справа). (A) успешно transfection HEK293T клеток с pTransgene GFP-кодирования подтверждается флуоресценции изображений. (B) HEK293T рассматривается исключительно с реагентами transfection клетки показывают не экспрессия гена GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Урожай, средне- и 72 ч после transfection клетки. Используйте скребок ячейки для аккуратно отсоединить клетки от культуры блюдо. Соберите средне- и клетки в 50 мл Конические трубки хранится на льду.Примечание: Содержимое двух блюд культуры клеток могут быть собраны в единый 50 мл Конические трубки. В конце этого шага каждый из девяти трубок будет содержать примерно 50 мл среды. Центрифуга конические трубы на 420 x g 10 мин при температуре 4 ° C с ускорение и замедление центрифуги, максимальная. Тщательно удалить супернатант от каждой трубы. Не используйте пипетки для предотвращения потери материала. Вместо этого аккуратно вылить супернатант в контейнер отходов и место пробирки, содержащие ячейки гранулы обратно на льду. Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 2 мл буфера lysis непосредственно в 50 мл Конические трубки, закупорить вверх и вниз по 5 – 10 x. Сделать не вихря. Бильярд лизатов из трех труб вместе.Примечание: На данный момент будет три 50 мл конические трубы, каждый один содержащие 6 мл ресуспензированы клеток литического буфера. 2. AAV вектор очистки Примечание: Производительность данного раздела протокола занимает примерно 1 день. Выполните следующие действия одновременно на каждом из трех 50 мл конические пробирки, содержащие высокомобильна в буфер lysis клетки (см. предыдущее Примечание). Замораживание и размораживание ресуспензированы клетки 3 x лизируют их и освободить AAV частиц. Выполните шаг замораживания, поместив трубы в ведро, содержащих сухой лед, смешивается с этанолом. Выполнить, оттаивания, немедленно поставив клетки на водяной бане в 37 ° C. После третьего шага оттаивания центрифуги на 1,167 x g 15 мин при 4 ° C.Примечание: Будет сформирована заметно Пелле, состоящая из клеток мусора. При обработке труб, Избегайте резких движений, поскольку они могут вызвать отряд гранулы в надосадке, которая поставит под угрозу чистоту окончательного вектора. Тщательно передачи supernatants очистить 50 мл конические трубы и затем добавить нуклеиназы в каждую пробирку, чтобы конечная концентрация супернатанта 50 ед/мл. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C. Вихрем 50 мл конические трубы вручную каждые 10 мин для обеспечения что нуклеиназы тщательно смешивается с супернатант. Уточнить супернатант центрифугированием при 13,490 x g 20 мин при 4 ° C. Прикрепить фильтр 0,45 мкм до 10 мл шприц и разместить его на вершине чистой 50 мл Конические трубки. Осторожно удалите поршень и заполните шприц с супернатант с шагом 2.5. Используйте поршень lysate через фильтр. Используйте новый фильтр и шприц для каждой трубы супернатанта, полученного на шаге 2.5.Примечание: Полученные фракции известен как «сырой lysate». Подготовка каждого из 15%, 25%, 40% и 60% iodixanol фракций в четырех отдельных 50 мл конические трубы, согласно инструкциям, приведенным в таблице 1. Подготовка iodixanol градиенты в трех ultracentrifugation трубы, используя следующий порядок iodixanol фракций: 8 мл 15% iodixanol, 5,5 мл 25% iodixanol, 5 мл 40% iodixanol и 4,5 мл 60% iodixanol.ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Iodixanol может вызвать раздражение глаз, кожи и желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. При обработке iodixanol градиенты, носить перчатки и работать под капотом ламинарного потока. Пипетка 8 мл 15% iodixanol в каждую пробирку ultracentrifugation. Пипетка 5,5 мл 25% раствора iodixanol в чистой 50 мл Конические трубки (рис. 1A). Используйте-окончил пипетка Пастера (как шея ultracentrifugation трубка слишком узким для обычных Пипетки градуированные) тщательно слоя 5,5 мл 25% раствора iodixanol ниже 15% iodixanol раствор (рис. 1B).Примечание: Это может быть успешно достигнуто путем добавления iodixanol в три этапа, поскольку пипетка Пастера может содержать только около 2 мл. Добавьте 40% и 60% iodixanol решений, как описано в шаге 2.9.3. Не беспокоить интерфейсы различных iodixanol во время наложения.Примечание: Надлежащей подготовки различных iodixanol фракции может быть обеспечено путем визуального подтверждения благодаря фенола красного, добавлены к iodixanol фракции (см. инструкции в таблице 1). Поскольку каждая фракция имеет плотность, они будут не перемешивают во время шага наслаивать, если она выполняется правильно (проверить Рисунок 1 c). Слой сырой lysate поверх 15% iodixanol градиент с пипетка Пастера. Перейти капля по капле, чтобы не мешать интерфейс между lysate сырой и iodixanol решения. Заполните ultracentrifugation трубка с литического буфера до тех пор, пока мениска достигает основания шеи пробки, чтобы убедиться, что труба не разрушается под очень высоким сил, возникающих во время ultracentrifugation (рис. 1 c). Закройте ultracentrifugation трубы, используя соответствующие крышками. Используйте цифровую шкалу чтобы убедиться, что все три ultracentrifugation трубы имеют такой же вес. При необходимости, отрегулируйте вес, добавив больше литического буфера поверх сырой lysate.Примечание: Вес разница между ultracentrifugation трубы должна быть ниже 0,1 g для обеспечения безопасной эксплуатации ультрацентрифугирования. Ультрацентрифуги являются потенциально опасных частей оборудования и должен использоваться только надлежащим образом подготовленным персоналом. Центрифуга для труб на 301,580 x g, используя фиксированный угол титана ротора, 1 ч. и 40 мин при 12 ° C, с использованием максимальной скорости, ускорения и замедления. Осторожно вставьте тупой иглой из нержавеющей стали на 40% и 60% iodixanol интерфейс. Прикрепите иглу в шприц 5 мл (Рисунок 1E). Аспирационная только четкие дроби, содержащий вектор частицы.Примечание: Общий объем собранных составляет примерно 2,5-3 мл. Избегайте коллекции материалов из интерфейса 25 – 40%, так как это увеличит уровень загрязнения в пакете окончательного вектора, благодаря наличию нежелательным белков. Процесс собираемой фракции (обессоливания и концентрации) или сохранить его на ночь при 4 ° C. Рисунок 1: Установка для очистки градиента iodixanol и последующих векторных коллекции. (A) перед дозирование различных iodixanol градиенты в ultracentrifugation трубу, Пипетка достаточное количество каждого решения iodixanol в отдельный Конические трубки. (B) затем используйте Пастер Пипетка передать последовательно каждый iodixanol решение ultracentrifugation трубки: слои iodixanol все более высокие концентрации должны быть добавлены в нижней части трубки под предыдущие слои. (C) слоя сырой вектор lysate на вершине раз градиенте был подготовлен. Эта система сбора вектор не используйте острые иглы, которые представляют риск «иглами». (D) A из нержавеющей стали 316-шприц игла вводится через iodixanol градиента до 40/60% iodixanol интерфейс. (E) вектор частицы находятся в фазе iodixanol 40% и собраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 3. обессоливания и концентрации вектора AAV Примечание: Производительность этого раздела протокола занимает приблизительно 2 ч. Prerinse мембране фильтра центробежного фильтра, добавив 5 мл 1 x PBS-МК и центрифуги для 5 мин на 4000 x g. Добавьте 5 мл 1 x PBS-МК в собираемой фракции вектора AAV, смешать и затем добавить общий объем фильтра. После добавления 1 x PBS-МК, наблюдается помутнение. Центрифуга на 4000 x g до тома на конусообразный фильтр был сокращен до 1 мл. Отказаться от потока через накопленных в трубке внешней коллекции. Добавить 13 мл 1 x PBS-МК конусообразный фильтр и повторить центрифугирования шаг как столько раз, сколько необходимо (минимум 3 x), пока не более мутность наблюдается когда свежие 1 x добавляется PBS-МК. В финале мыть шаг, добавить 13 мл PBS + 0,01% (v/v) неионных ПАВ и центрифуги на 4000 x g до тех пор, пока объем уменьшается до 300-350 мкл. Соберите остальные фракции настоящее на фильтр, закупорить весь объем в стерильных обогнул microcentrifuge трубку.Примечание: Эта фракция содержит вектора AAV обессоленной и сосредоточены. В следующих шагах этого протокола эта часть называется «основной» фракция. Убедитесь, что для обработки труб под капотом и хранить при 4 ° C. Промойте фильтр с 200 мкл 1 x PBS-МК для сбора остаточной вектор частицы, сохранил на фильтре. Соберите в стерильных microcentrifuge трубку.Примечание: Это разреженных вектор запасов, которые могут быть пригодны для некоторых приложений, требующих меньше вектор титры. В будущих шагов эта часть называется «среднее» фракция. Для краткосрочного хранения магазин вектора fraction(s) на 4 ° C (менее чем за 2 недели). Алиготе и магазин вектора в ‑20 ° C при необходимости длительного хранения. Выполните контроль качества, как описано в разделе 4. 4. титрование вектора количественных полимеразной цепной реакции Примечание: Производительность этого раздела протокола занимает около 3 часов. Калибровочной кривой Линеаризации трансген выражая плазмида (pTransgene) используется для transfection клетки ГЭС 293T в разделе 1. Подготовьте ограничение дайджест микс в пробки microcentrifuge 0,5 мл (см. Таблицу 2 состав ограничение дайджест микс).Примечание: Настройте состав ограничение дайджест микс соответствии фермента используется и соответствующие руководящие указания от производителя. Инкубировать ограничение дайджест микс для 1 ч при 37 ° C. Проверьте, что эффективность пищеварение ограничения, запустив линеаризованного плазмида на геле агарозы 0,8% (w/v) на 100 V на 1 ч. полное переваривание плазмида следует производить один фрагмент определенного размера. Очистить линейной плазмидной ДНК, используя набор для очистки ПЦР, следуя инструкциям производителя24, и измерения концентрации ДНК с спектрофотометр путем измерения поглощения на 260 Нм. После титрования храните остальные Алиготе линейных плазмид в ‑20 ° C для дальнейшего использования. Рассчитайте молекул (т.е. копии ДНК) акций плазмида в микролитр следующим образом. Во-первых вычислить молекулярный вес плазмиды. Предполагая, что средний вес пары ДНК (bp) 650 Дальтон (Da) и что один моль bp весит 650 g, молекулярный вес любой шаблон двуцепочечной ДНК могут быть оценены, принимая продукт его длину (в bp) и вес пары.Плазмиды молекулярный вес [г/моль] = плазмида размер [ВР] x 650 [Да/bp] Далее Вычислите количество молей плазмида в микролитр.Кроты плазмида в микролитр = концентрация плазмида [g/мкл] / плазмида молекулярный вес [г/моль]Примечание: Обратное значение молекулярной массы — это количество молей плазмида в 1 g материала. Затем вычислите количество плазмида молекул в микролитр, используя число Авогадро (6.022 x 1023 молекул/моль).Молекулы плазмида в микролитр = молей плазмида в микролитр [моль/мкл] x число Авогадро [молекул/моль] Наконец разбавляют плазмида фондовой (молекул/мкл) для получения 100 мкл раствора с желаемой концентрации молекул 1 х 109 (геномов (vg) вектор в микролитр).Плазмиды складе (100 мкл) = (желаемой концентрации [молекул/мкл] x 100 мкл) / плазмида молекул [молекул/мкл] Сделайте серийных разведений плазмида акций (1 х 109 vg/мкл) в triplicates:10 мкл 1 х 109 vg/мкл плазмида фондовой + 90 мкл H2O = 1 х 108 vg/мкл раствора10 мкл разрежения vg/мкл8 1 x 10 + 90 мкл H2O = 1 х 107 vg/мкл раствора10 мкл 1 x 10-7 vg/мкл разрежения + 90 мкл H2O = 1 х 106 vg/мкл раствора10 мкл разрежения vg/мкл6 1 x 10 + 90 мкл H2O = 1 х 105 vg/мкл раствораПродолжать получать 1 x 101 vg/мкл раствора. Держите серийных разведений стандартных плазмида акций на льду до их загрузки на пластину ПЦР (раздел 4.3). Компонент Сумма 10 x буфер энзима ограничения 5 МКЛ Энзима ограничения 2,5 МКЛ Плазмиды 5 мкг H2O до 50 мкл Таблица 2: Ограничение дайджест микс композиция. Таблица 3: Калькулятор том складе плазмида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Экстракции ДНК из вектора AAV Смешайте 2 мкл AAV вектор фондовой (Основная фракция от шаг 3.5) с 198 мкл DNase I буфера (1 x) в трубки газа (ПЦР трубы) и 2 мкл DNase I.Примечание: DNase я снижают любой генетический материал, который не содержится внутри вектор капсида, (который бы исказить результаты ПЦР). Это решение называется разбавления «dil1 x 10-2». Инкубируйте 30 минут при 37 ° C, а затем 10 мин при 95 ° C.Примечание: Протокол может быть остановлен на данный момент, и материал может храниться бесконечно при 4 ° C, чтобы избежать ухудшения продукта. 2 мкл протеиназы K к решению dil1 x 10-2 (шаг 4.2.1) и проинкубируйте 60 мин при 50 ° C, а затем 20 мин при 95 ° C.Примечание: Этот шаг будет разбирать капсид вектора AAV и отпустите геном вектора AAV в раствор. Добавьте протеиназы K в избыток белка (капсид) содержимое образца не известно. Обратите внимание, что крайне важно для обеспечения удаления всех протеиназы K деятельность по денатурации, до ПЦР, чтобы избежать проблем с деградацией полимеразы (частично), влияющих на конечный результат. Готовят 1:10 серийных разведений раствора протеиназы K лечение dil1 x 10-2 (шаг 4.2.3) в 1,5 мл пробирок microcentrifuge следующим образом:10 мкл dil1 x 10-2 + 90 мкл H2O = dil1 x 10-3 разрежения10 мкл dil1 x 10-3 + 90 мкл H2O = dil1 x 10-4разбавления10 мкл of dil1 x 10-4 + 90 мкл H2O = dil1 x 10-5 разрежения Держите серийных разведений ДНК, извлеченные из вектора на льду до их загрузки на пластину ПЦР (раздел 4.3). Титрование по ПЦР на основе обнаружения SYBR зеленый Подготовка мастер смесь ПЦР в пробки microcentrifuge 1,5 мл, для образца и стандартов. Использование 10 мкл SYBR зеленый Мастер микс, 1 мкл вперед грунтовка (акции 10 мкм), 1 мкл обратного праймера (акции 10 мкм) и 3 мкл H2O на реакции. Смотреть протокол в таблице 4 для последовательностей праймера. Пипетка мастер смесь ПЦР вверх и вниз, но сделать не вихря. 15 мкл ПЦР мастер смеси, а затем либо 5 мкл калибровочной кривой, подготовленный в разделе 4.1 или ДНК, извлеченные из вектора AAV в разделе 4.2, в каждой скважине. Включать три колодца, содержащие только мастер смеси ПЦР, как отрицательный контроль. Обратитесь к рис плита макета. Уплотнение пластина уплотнительная пленкой и кратко центрифуга пластину ПЦР на 1500 x g за 30 сек при 4 ° C. Запуск реакции ПЦР на основанного на пластину в реальном времени PCR амплификация и обнаружения инструменте, используя условия, предложенные в таблице 5. Грунтовка имя Последовательность Форвард грунтовка 5′-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3′ Обратный грунтовка 5′-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3′ Таблица 4: Грунтовка последовательности, направленных против промоутер ЦБА. Рисунок 2: плита макет для ПЦР-векторной титрования. Образцы цвет: зеленый = калибровочной кривой; синий = H2O управления; серый = Основная фракция; оранжевый = вторичный дроби. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Шаг Время Температура Циклы Цель Предварительной инкубации 5 мин 95 ° C x1 Денатурации и полимеразы Активация ДНК (горячий старт реакции). Усилители 10 мин 95 ° C x1 Амплификация ДНК. Параметры могут быть оптимизированы, если используются альтернативные грунты с разной температуры отжига. 10 s 95 ° C X40 40 s 60 ° C 1 s 72 ° C Охлаждение 10 s 40 ° C x1 Плита охлаждения. Конец ПЦР. Таблица 5: Тепловой Велоспорт протокол для SYBR на основе зеленого ПЦР титрования. Анализ данных для определения титра вектора AAV Заполните ячейки данных таблицы (Таблица 6A) с КТ значения, полученные для различных разведениях стандартного образца, подготовленный в разделе 4.1 для создания стандартной кривой.Примечание: Уравнения стандартной кривой будет показан (y = ln (x) + b) вместе с R2 эффективности (таблица 6B). ПЦР должны иметь эффективность близка к 100% и R2 близка к 1.0 (≥ 0,96). Используйте вычисленные значения и b для заполнения соответствующих ячеек данных в таблице (таблица 6 c). Заполните таблицу с КТ значения, полученные для различных разведениях образца AAV, подготовленный в разделе 4.2. Рассчитайте средний титр вектора AAV в вектор геномов в микролитр фракции «основной» с использованием следующей формулы:Примечание: фактор 400 используется для одного мель геномов, в то время как sc геномов использовать коэффициент умножения 20025. В самом деле, как двойной во время каждого цикла ПЦР, ДНК количествах sc, что ДНК обнаружено 2 x по сравнению с СС генома. Титрование направлена для расчета концентрации с точки зрения вектор геномов в микролитр. Коррекция необходима для запуска ПЦР при использовании 2 мкл исходного материала (шаг 4.2.1). Дил представляет факторы разрежения от шага 4.2.4. Титр «среднее» фракция вектора AAV (шаг 3,6) может быть рассчитана одновременно. Таблица 6: шаблон для анализа данных ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 5. чистоту управления SDS-PAGE и Серебряный пятнать Примечание: Производительность этого раздела протокола занимает около 5 ч. Тщательно очистить стеклянные пластины, используемые для литья гели используйте 70% (v/v) этанола. Соберите систему литья геля. Обеспечить не сколы днища стеклянные пластины, для предотвращения утечки акриламида смеси при приведении геля. Подготовьте укладки и разрешая гель решения в двух отдельных 50 мл конические трубы. Опустите tetramethylethylenediamine (TEMED) и 10% (w/v) Аммония пероксодисульфат (APS), поскольку они отвечают за полимеризации геля. Добавьте их непосредственно перед заливкой геля.Примечание: Влияет на окончательный процент акриламида в геле профиль разделение белков: как правило, будет достаточно для тестирования чистоты подготовки вектора AAV 10% (v/v) конечной концентрации акриламида. Смешайте нежно закрученного трубка, содержащая компоненты геля. Сделать не вихря, так как чрезмерное оксигенации может ухудшить полимеризации. Добавьте TEMED и 10% (w/v) APS разрешая гель решение. Перемешать, а затем налить в гель держатель до тех пор, пока она достигает 1-2 см ниже верхней части небольшой стеклянной пластины. Уложите слой воды насыщенный бутанол на вершине смесь акриламида. Это обеспечит формирование плоской поверхности в процессе полимеризации. Не оставляйте гель под алкоголь более чем на 30 мин, как это будет обезвоживает гель и ухудшить его функции.Предупреждение: Бутанол опасных в случае контакта с кожей. Он также представляет риск пожара. Обращаться с осторожностью. Подождите, пока гель для полимеризации и затем слейте бутанол. Совет: Проверьте укрепила ли смесь лишний гель в тубе. Полимеризация происходит в менее чем 20 минут вымыть поверхность геля с H2O и затем высушить его используя бумажные полотенца, стараясь не нарушить поверхности геля. Добавьте TEMED и 10% w/v APS штабелируя гель и залить гель гель держатель на вершине отделяя гель. Место предоставленный гребень в гель. Выполнение этого действия с одним постоянное движение, чтобы избежать образования воздушных пузырьков внутри колодцев. Подождите, по крайней мере 20 минут для геля для полимеризации. Совет: Проверьте, если избыток геля смешать затвердевшим Конические трубки. Подготовить две смеси (таблица 7) для первичной и вторичной AAV вектор фракций (шаги 3.5 и 3.6, соответственно). Высокая сумма Низкая сумма AAV вектор фондовой 5 МКЛ 1 МКЛ 5 x буфер образца 3 МКЛ 3 МКЛ H2O 7 МКЛ 11 МКЛ Таблица 7: Состав смеси образца, необходимых для Серебряный пятнать. Полностью Денатурируйте образцы смеси путем нагревать их за 5 мин при 95 ° C. Соберите танк электрофореза, обращая внимание на электрод ориентацию. Заполните бак с 1 x катод буфера на внутренней стороне электрода Ассамблеи и 1 x анодном буфере снаружи.Примечание: Анодный буфер может быть рециркулированных от запуска к запуску. Свежий катод буфер должен всегда использоваться. Снимите гребень из геля и очистки скважины гель с 1 x катод буфера. Загрузите 1 мкл белка лестницы в колодец. Загрузите образец смесей в различных скважин на же гель (рис. 3). Побегите гель на 50 V до тех пор, пока образцы введите разрешая гель. Затем увеличивайте напряжение 100 V до тех пор, пока краска фронта достигает нижнего предела геля. Извлечь гель тщательно из стекла и использовать Серебряные пятная комплект (согласно инструкциям производителя26) для визуализации вирусные белки (VP1, VP2 и VP3 подразделения), которые составляют AAV капсида, а также о том, как проверить для возможного загрязнение протеина (рис. 3). Рисунок 3: Оценка чистоты вектор с помощью SDS-PAGE и Серебряные пятная. Использование геля SDS Трицин, 5 мкл различных векторных препаратов были отделены. Белки были впоследствии обнаружены Серебряный пятнать. Векторы считаются чисто, когда VP1 (82 кДа), VP2 (67 кДа) и VP3 (60 kDa) видны в 1:1:10 соотношение (полоса 1), без чрезмерного фон (пер. 2) или неспецифичных (пер. 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Representative Results

AAV9 считался, до недавнего времени, чтобы быть наиболее эффективным серотип вектора AAV в пересечении BBB и преобразователя клетки ЦНС, после периферийных администрации. Был достигнут значительный прогресс в капсид дизайн при Deverman et al. сообщили об использовании метода отбора капсид под названием Cre AAV-целевой основе рекомбинации эволюции (CREATE)17. С помощью этого метода, они определили новый капсида, названный PHP. B, в которых они сообщили, как способными передавать большинство астроциты и нейронов в нескольких регионах, ЦНС, после системного инъекции17. На данный момент, она должна быть отметил, что хотя PHP. B обеспечивает положительные результаты у мышей C57/Bl6 (что было напряжение, используемая в экспериментах по первоначальной изоляции), предварительные доклады предположить, что его эффективность может отличаться в зависимости от штамма. Без сомнения, дальнейшие эксперименты прольет больше света на этот вопрос31. Однако несмотря на эти проблемы, PHP. B предлагает захватывающие возможности для неинвазивной генные манипуляции в ЦНС мышей, включая доказательства в концепция генной терапии эксперименты в модели заболеванием. Таким образом мы решили оценить эффективность трансген выражения с использованием PHP. B против AAV9, который был «золотой стандарт» вектор для трансдукции ЦНС после периферийных администрации начиная с 2009 года2. Чтобы выполнить прямое сравнение обоих серотипов, при оптимальных условиях для выражения трансген, мы использовали генома конфигурации sc32. Обе векторов осуществляется трансген для зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) под контролем промотора вездесущие курица β-актина (ЦБА). Самок мышей C57/Bl6 на послеродовой день 42 (примерно 20 г веса) получил дозу 1 x 1012 вол на мыши или scAAV2/PHP. B-СВА-GFP или scAAV2/9-СВА-GFP. Векторное управление был осуществляется через инъекции Вену хвост. Эксперименты были утверждены Этический Комитет ку Лёвен. Три недели postinjection, мышей прошли transcardial перфузии с ледяной PBS, следуют ледяной параформальдегида 4% (w/v) (PFA). Их мозг были собраны и прошли дальше postfixation на ночь инкубации в том же фиксатором, перед передачей на 0,01% (w/v) Na азид/PBS для хранения до дальнейшего анализа. Потом мозги были секционного с помощью вибрационного микротом, и иммуногистохимии была выполнена на 50 µm толщиной секций. Для оценки уровней экспрессии трансген, разделы окрашивали с первичных антител против GFP (кролик анти GFP), обнаружения, используя вторичные антитела, конъюгированных Люминесцентную краску (анти кролик Alexa Fluor 488) (рис. 4A, B ). Измерения интенсивности флуоресценции (в произвольных единицах [au]) подтвердили значительное увеличение экспрессии гена GFP когда sc генома и PHP. B капсид были использованы по отношению к AAV9. Увеличение ГФП были замечены в головном мозге (2105 ± 161 против 1441 ± 99 АС; p = 0,0032), мозжечок (2601 ± 196 против 1737 ± 135 АС; p = 0,0032) и ствола мозга (3082 ± 319 против 2485 ± 88 АС; p = 0.0038) (рис. 4 c). Рисунок 4: Системные поставки scAAV2/PHP. B-СВА-GFP приводит к высокой экспрессия гена GFP в ЦНС. scAAV2/PHP. B-СВА-GFP или scAAV2/9-СВА-GFP (1 x 1012 vg/мышь) осуществлялось до 6 недель old мышей C57/Bl6 через инъекции Вену хвост. GFP был обнаружен с помощью иммуногистохимия на корональных мозга секции 3 недели postinjection. (A) головного мозга и (B) показаны мозжечка и ствола мозга. Масштаб баров = 1 mm. (C) была выполнена количественная оценка интенсивности флуоресценции относительной для определения уровней сигнала GFP с каждый вектор (10 секций на мышь; три мыши на вектор группы). Была выполнена односторонней теста ANOVA, следуют две Стьюдента t-теста; Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение; p < 0.01; АС. условные единицы. pCapsid, используемые для производства вектора AAV, содержит генов rep от серотипа 2 и гена колпачок от серотип PHP. B или AAV9, соответственно. Эта цифра была изменена от Rincon et al.32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Производство рекомбинантных векторы AAV описано здесь использует материалы и оборудование, общие для большинства лаборатории молекулярной биологии и зал культуры клеток. Это позволяет пользователю получить чистый, доклинические класс векторы AAV, которые могут использоваться для нескольких типов клеток и тканей по спектру приложений in vitro и in vivo . Один из самых больших преимуществ этого протокола, по сравнению с другими (то есть, на основе CsCl очистки), — короче рабочее время требуется. Готовые к использованию векторы AAV достижимы в максимум 6 рабочих дней после первоначального transfection клетки HEK293T.

Некоторые факторы могут негативно повлиять окончательный выход или качество вектора AAV. Бедные трансфекции эффективность является одним из главных причин низкой вирусной урожайности33. Одной из основных рекомендаций является использование HEK293T клетки, которые не были пассированной более чем 20 раз и не имеют слияния клеток, больше чем 90% на момент трансфекции21. Кроме того метод трансфекции выбранный имеет существенное влияние на результаты. Этот протокол основан на использовании PEI. Пей-Катионный полимер с возможностью доставить экзогенной ДНК в ядре клетки через поколение комплексов полимера и нуклеиновых кислот, известный как polyplexes, которые занимают ячейку и торговли через endosomes34. На основе PEI трансфекции легко и быстро выполнять, в отличие от других широко используемых методов, например совместного осадков ДНК с фосфата кальция35. Кроме того на основе PEI трансфекции намного дешевле по сравнению с другими новые методы, такие как использование катионных липиды и магнит опосредованной трансфекции36.

В стратегии очистки играет ключевую роль в протоколе. По сравнению с другими методами, на основе iodixanol очищения, как правило, содержат более высокий процент пустых вирусных частиц (20%)20. Это компенсируется, до некоторой степени, тот факт, что на основе iodixanol очистки регулярно приводит в подготовке вектора AAV с коэффициентом частиц инфективности меньше 100. Это представляет собой значительное улучшение по сравнению с обычной процедуры, основанные на CsCl, сообщил37которых является существенная потеря инфективности частиц. Другой общий альтернативный способ очистить векторы AAV — на основе хроматографии очистки. Однако этот метод имеет большой недостаток, что определенный столбец требуется для каждого вектора капсид используется: например, в то время как AAV2 классически изолированы с помощью столбцов гепарина, эта методология не работает с AAV4 и AAV5, которые не обладают гепарин привязки сайты на их capsids38. Учитывая, что хроматографии очистки также дорого, на основе iodixanol очистки обычно больше подходит для лабораторий, которые желают производить высококачественные пакеты векторы AAV на малых масштабах33,39, 40. Однако, чтобы максимизировать окончательные урожайности и чистоты вектора, крайнюю осторожность необходима при принятии iodixanol градиенты. Различные фракции iodixanol должны быть переданы ultracentrifugation трубки, используя стерильные пипетки Пастера чьи оконечности соприкасается стенке трубки: iodixanol должен быть выслан из пипетки, медленно и непрерывно. Как вектор частицы накапливаются в слое iodixanol 40%, необходимо обеспечить, что градиент интерфейсы не смешивать20. Наконец фракция, содержащий вектор должен быть восстановлен путем вставки тупой иглой из нержавеющей стали с габаритом не более 20 г. Для максимального восстановления вектор, четкие дроби должны быть восстановлены в полном объеме. Во время этого шага сроки имеет решающее значение. Чтобы избежать ущерба для чистоты подготовки, важно остановить коллекцию, прежде чем собираются другие (загрязняющих) этапы градиента.

Различия в полученных векторных титр может также объясняться вектора внутреннюю способность производить упакованных частиц. Сравнение между различными AAV серотипов показал, что некоторые векторы AAV сложнее производить на высокий титр, чем другие (например, AAV2)41. Осадков вектора, опреснительные этапе, может быть возможной причиной для нижней титр и легко предотвратить, избегая чрезмерной33. Кроме того это также возможно, что эффективность очистки на основе градиент iodixanol слегка отличается между серотипов, и, таким образом, расхождения в титре, полученных с различных серотипов может наблюдаться41.

Наконец необходимо отметить, что хотя ПЦР является очень точным методом для количественного определения ДНК могут наблюдаться некоторые присущие изменчивость в технике. Точность в титрования главным образом зависит от точное дозирование и надлежащего vortexing всех решений. Чтобы обеспечить наиболее точные титр чтения, ПЦР может повторяться самостоятельно, и полученные значения в среднем. Выбор грунтовки, представленные в настоящем Протоколе основан на последовательности промоутер ЦБА, расположенных в pTransgene плазмиды, используемых в нашей лаборатории. Промоутер АЗВ является сильным синтетических промоутер, который широко используется в векторное поле выражение диск через несколько типов клеток. Она включает в себя несколько элементов, включая элемент раннего усилитель цитомегаловирусом (CMV); Промоутер, первый экзона и первый Интрон ЦБА гена; и сращивания акцептор гена β-глобина кролика. Однако грунты могут быть спроектированы для практически любой элемент, расположенный в пределах выражения кассеты (включая промоутер, трансген и нормативных элементов). Также возможна сравнение титр через пакеты, предоставляя праймеры используются против общих для векторов в регионах.

В заключение этот протокол может использоваться для производства векторы AAV с различными capsids, геном конфигураций, промоутер типов и трансген грузов. Это позволит пользователям легко адаптировать окончательные характеристики их векторов, Лучший экспериментальный потребностям. В этом примере представлен в результатах представительных, использование PHP. B капсида, которая эффективно пересекает BBB, дал высокоэффективных ген выражение в ЦНС, инъекции Вену следующие хвост32. Системные администрация ЦНС капиллярный векторов имеет значительные преимущества с точки зрения возможных побочных эффектов2,17,32. Возможной альтернативой периферийных инъекций, избегая предостережения инвазивных методов, является Интратекальное доставки, которая состоит из доставки вектора AAV в спинномозговую жидкость. Этот маршрут доставки доказано, чтобы быть эффективной, показаны широкое выражение трансген через ЦНС, меньше пробить эффекты в периферических органах и низкий уровень иммунной реакции42. Однако Интратекальное инъекции являются гораздо более сложным, поскольку они требуют более высоких технических навыков, чем инъекции Вену хвост.

Дальнейшее развитие капсид для уточнения этой технологии будет определяться возможности для использования вектора AAV в приложениях генной терапии. Такие подходы предлагают привлекательные возможности для лечения в настоящее время неизлечимых заболеваний ЦНС, например боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, Паркинсона и болезнь Альцгеймера18.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

М.р. поддерживается Fonds voor докторантура стипендий фламандского Vlaanderen институте (FWO) (133722/1204517N) и признает постоянную поддержку сердечно-сосудистой де Колумбии Фонд и Административный отдел науки, Технологии и инновации (Грант CT-FP44842-307-2016, код проекта 656671250485.). М.м. поддерживается докторских стипендий FWO (1S48018N). M.G.H. была поддержана VIB институциональных грантов и внешней поддержки для Alzheimer исследований (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Грант 1513616N) и Совет европейских исследований (ERC) (Грант начиная от Тьерри Latran фонд (SOD-VIP), Фонд 281961 – AstroFunc; Доказательство концепции Грант 713755 – AD-VIP). Авторы признают Jeason Haughton за его помощь с мыши земледелием, Стефани Кастальдо за ее помощь, выполняя инъекции Вену хвост и Каролин Eykens для предоставления изображений transfected клеток HEK293T. M.G.H. признает Майкл Dunlop, Питер Хикман и декан Харрисон.

Materials

Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100X) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic System 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37°C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Co2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Filter tips * Greiner bio-one 750257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 738257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 771257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F144801
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123600
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123615
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123601
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome?. Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17 (2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. . QIAGEN Plasmid Purification Handbook Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018)
  24. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  25. . ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) – Bulletin, ProteoSilver Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018)
  26. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  29. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  30. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  31. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  32. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  33. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  34. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  35. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  36. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  37. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  38. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  39. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  40. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).
  41. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Tags

Adeno-associated VirusAAV VectorsVector ProductionVector PurificationQuality ControlTransfectionHEK CellsPEIDPBSDMEMCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image