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신경과학

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Published: January 29, 2019
doi:
10.3791/58960
, , , ,
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience,KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

Summary

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Abstract

Gen Lieferung Tools basierend auf Adeno-assoziierten Viren (Flugabwehrpanzer) sind eine beliebte Wahl für die Lieferung von transgenen an das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich Gen-Therapie-Anwendungen. AAV-Vektoren sind nicht replizieren, trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und bieten langfristigen Transgene Ausdruck. Wichtiger ist, einige Serotypen, wie die neu beschriebene PHP. B, kann über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in Tiermodellen, nach systemischen Lieferung. AAV-Vektoren können effizient im Labor hergestellt werden. Stabile und reproduzierbare Protokolle sind jedoch erforderlich, AAV-Vektoren mit ausreichend Reinheitsgrade und Titer Werte hoch genug für in-Vivo Anwendungen zu erhalten. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Strategie für AAV Vektor Produktion, basierend auf einer Iodixanol gradient Reinigung Strategie. Die Iodixanol Reinigungsverfahren eignet sich für Chargen von hoher Titer AAV-Vektoren von hoher Reinheit zu erhalten, im Vergleich zu anderen Reinigungsverfahren. Darüber hinaus ist das Protokoll in der Regel schneller als andere Methoden, die derzeit beschrieben. Darüber hinaus eine quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)-Strategiespiel ist für eine schnelle und genaue Bestimmung der Vektor-Titer, sowie eine silberne Färbung Methode festzustellen, die Reinheit der Vektor Charge beschrieben. Zu guter Letzt repräsentative Ergebnisse der gen-Lieferung an die CNS nach systemischer Gabe von AAV-PHP. B, werden vorgestellt. Solche Ergebnisse sollte in allen Labors mit den Protokollen, die in diesem Artikel beschriebenen möglich sein.

Introduction

In den letzten 30 Jahren wurden Wildtyp Flugabwehrpanzer entwickelt, rekombinante AAV-Vektoren zu erstellen, die haben sich als außerordentlich nützliche Werkzeuge für den Gentransfer in die CNS1,2,3,4, 5,6 und Gen-Therapie Ansätze zur Krankheit (einschließlich der FDA und EMA zugelassene Therapien)4,7. Ihre Eignung für den Einsatz im ZNS ergibt sich weitgehend aus ihrer Fähigkeit, nicht teilen, Post-mitotische Zellen infizieren, in der Regel in der CNS8gefunden. AAV-basierte Vektoren haben jedoch auch den Vorteil, dass einen langfristige Ausdruck von jedem gegebenen therapeutischen Transgen4,9 während eine milderen Immunantwort im Vergleich zu anderen viralen Vektoren7zu entlocken, 8,10,11,12.

Die wichtigsten Elemente der jeden Vektor AAV sind das Genom und das Kapsid. Wildtyp Flugabwehrpanzer sind einzelsträngig (ss) DNA-Viren mit einem Genom ca. 5 Kilobases (kb)13. Für die Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren, die Rep und GAP Genen (notwendig für die Replikation des Genoms und die Montage von viralen Kapsid) aus dem Genom der Wildtyp AAV gelöscht und in Trans, lässt Raum für eine Expressionskassette enthält die Transgen-14,–15. Die invertierten terminal wiederholte Sequenzen (ITRs) des ursprünglichen Virusgenoms sind die einzigen beibehaltene Elemente in einen Vektor AAV sind unerlässlich für die Replikation und Verpackung3,10,14. AAV-Vektoren können entwickelt werden, um Transgene Ausdruck zu verbessern; eine Mutation in einem der ITRs führt zur Bildung einer Haarnadel-Schleife, die effektiv die Erzeugung eines komplementären DNA-Strang3,7,15 ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Konfiguration, eine selbst-ergänzende (sc) Genom bezeichnet ist, dass es die Notwendigkeit einer zweiten Strang Synthese typisch in den herkömmlichen Lebenszyklus der Flugabwehrpanzer, erheblich erhöhen die Geschwindigkeit und die Höhe der Transgen-Expression umgeht 1. dennoch mit einem ScAAV Genom die Ladekapazität des Vektors auf ca. 2,4 kb reduziert. Dazu gehören Transgen-Sequenzen, sowie alle regulatorischen Sequenzen wie Promotoren oder MicroRNA-Bindungsstellen, Ausdruck auf bestimmte Zelle Arten16zu beschränken.

Das AAV-Kapsid bestimmt die Vektor-Host Zelle Interaktion und verleiht ein Maß an Zelle Typ oder Gewebe Tropismus für ein AAV-Serotyp, die auch ausgenutzt werden kann, um Transgene Ausdruck an bestimmte Orte zu beschränken. Mehreren AAV Serotypen sind in der Natur gefunden, während andere im Labor durch rekombinante Ansätze (z.B. PHP. hergestellt wurden (B). Darüber hinaus einige Capsids verleihen auch andere nützlichen Eigenschaften, wie die Fähigkeit, die BBB, wodurch die Lieferung von transgenen in der CNS nach systemischen Verabreichung zu überqueren. Dies hat für AAV9 sowie für die kürzlich beschriebene PHP gezeigt. B Kapsid17. Infolgedessen sind diese Serotypen erweist sich als besonders relevant für neue Gen-Therapie-Ansätze für Neurodegenerative Erkrankungen1,17,18.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine kostengünstige Methode für die Kleinserienproduktion der AAV-Vektoren mit hoher Titer und Reinheit zu beschreiben. Obwohl die hier vorgestellten Ergebnisse die PHP verwenden. B Kapsid und ein ScAAV Expressionskassette, eignet sich das Protokoll für die Produktion von mehreren AAV-Vektor-Serotypen und Genom-Konfigurationen, maximale experimentelle Flexibilität erlaubt. Jedoch können der Vektor Ertrag und die endgültige Reinheit abhängig von der gewählten Serotyp variieren.

Das Protokoll selbst ist eine Variante der klassischen Tri-Transfektion Methode für die Produktion von viralen Vektoren und beinhaltet die Verwendung von einer Iodixanol Steigung für Vektor-Bereinigung, die, im Vergleich zu der klassischen Verwendung von Cäsium-Chlorid (CsCl) Gradienten, wurde berichtet, dass um AAV-Vektoren von höherer Reinheit in einer Zeit effizienter Weise19,20,21zu produzieren.

Die Transfektion, Reinigung und Konzentration Schritte sollen entsprechend gute Laborpraxis (GLP) durchgeführt werden, in einer Gewebekultur Labor für virale Vektor Arbeit bewertet. Jede Aufgabe muss in Übereinstimmung mit den einschlägigen lokalen und nationalen Rechtsvorschriften zur Produktion von viralen Vektoren durchgeführt werden und verwenden. Arbeit muss unter einem Laminar-Flow-Haube und unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Im Inneren der Vektor-Anlage empfiehlt es sich, einen Laborkittel, zusätzlich zu den regulären Gewebekultur Laborkittel zu tragen. Darüber hinaus sollte ein doppeltes Paar Handschuhe sowie Kunststoff Überschuhe jederzeit getragen werden.

Vor Beginn der Vektor-Produktion gewährleisten die notwendige Ausrüstung und Plasmide verfügbar sind. (1) pCapsid Plasmid enthält das Rep -gen, das vier Nichtstrukturproteinen notwendig für die Replikation, Rep78, Rep68, Rep52 und Rep40, codiert und der GAP -gen, das drei strukturelle Kapsid-Proteine, nämlich VP1, VP2 und VP3 kodiert. (2) pHelper Plasmid enthält die Gene, E4, E2Aund VA von Adenovirus, die AAV Produktion in HEK293T Zellen zu erleichtern. (3) pTransgene Plasmid enthält das Transgen Expressionskassette, flankiert von zwei ITRs. Diese Plasmide kann synthetisiert de Novo im Labor mit Sequenzen zur Verfügung online-22. Für Plasmide de Novogemacht ist vor allem solche, die neuartige transgene Sequenzierung erforderlich, um sicherzustellen, dass das Transgen und ITRs korrekt sind. Vorgefertigten Plasmide können alternativ direkt durch Online-Plasmid Repositories erworben werden. Bei Bedarf, Plasmide können verstärkt werden und gereinigt mit standard-Kits, gemäß des Herstellers Anweisungen23.

Vektor-Titer und Reinheit können die Transduktion Fähigkeit des Vektors beeinträchtigen. Zusatzprotokolle werden geliefert, um die Qualität des produzierten Vektors zu bewerten. Die endgültige Vektoren werden für Studien der CNS-Zellfunktion in in Vitro und in Vivo Anwendungen nützlich sein.

Protocol

Lösung Zusammensetzung Zellkultur und Transfektion DMEM1 DMEM 1 X 1 % FBS (V/V) 1 % GlutaMAX (V/V) DMEM10 DMEM 1 X 10 % FBS (V/V) 1 % GlutaMAX (V/V) 150 mM NaCl 4,380 g NaCl Bis zu 500 mL Reinstwasser AAV-Reinigung und Entsalzung 5 M NaCl 146,1 g NaCl Bis zu 500 mL Reinstwasser 1 M Tris-HCl (pH 8,5) 12,11 g Tris-base VORSICHT Bis zu 100 mL Reinstwasser Fügen Sie 1 M HCl mit einer Pasteurpipette, den pH-Wert auf 8,5 zu reduzieren Lyse-Puffer 15 mL 5 M NaCl 25 mL 1 M Tris-HCl (pH 8,5) VORSICHT Bis zu 500 mL Reinstwasser 10 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 80 g NaCl 2 g KCl VORSICHT 14,4 g Na2HPO4 2,4 g KH2PO4 Bis zu 1 L Dd-Wasser 1 M MgCl2 20,33 g MgCl2-6 H2O Bis zu 100 mL Reinstwasser 1 M KCl 7,45 g KCl VORSICHT Bis zu 100 mL Reinstwasser 5 x Stammlösung PBS Magnesium-Kalium (PBS-MK) 250 mL 10 X PBS 2,5 mL 1 M MgCl2 6,25 mL 1 M KCl VORSICHT Bis zu 500 mL Wasser Reinstwasser H2O 15 % Iodixanol 12,5 mL Optiprep Dichte Gradienten medium VORSICHT 10 mL 5 M NaCl 10 mL 5 x PBS-MK 17,5 mL Reinstwasser 25 % Iodixanol 20,8 mL Optiprep Dichte Gradienten medium VORSICHT 10 mL 5 x PBS-MK 19,2 mL Reinstwasser 100 µL Phenol rot 40 % Iodixanol 33,3 mL Optiprep Dichte Gradienten medium VORSICHT 10 mL 5 x PBS-MK 6,7 mL Reinstwasser 60 % Iodixanol 50 mL Optiprep Dichte Gradienten medium VORSICHT 100 µL Phenol rot VORSICHT AAV-Reinheitskontrolle 10 x Tris Acetat EDTA (Tee) Puffer 44,8 g Tris-base VORSICHT 11,4 mL Eisessig (17.4M) 3,7 g EDTA Bis zu 1 L Reinstwasser Agarose-gel 0,8 g Ultrapure agarose Bis zu 100 mL 1 X Tee Puffer Gel-Puffer 181,7 g Tris-base VORSICHT 1,5 g SDS VORSICHT PH bis 8.45 Uhr mit 1 M HCl anpassen VORSICHT Bis zu 500 mL Reinstwasser Kathode Puffer 10 x 121,14 g Tris-base VORSICHT 179,2 g Tricine VORSICHT 1 % SDS (w/w) VORSICHT Bis zu 1 L Reinstwasser Anode Puffer 10 x 242,3 g Tris-base VORSICHT Bis zu 1 L Reinstwasser PH bis 8,9 mit 1 M HCl anpassen VORSICHT Probe-Puffer 5 x Für 20 mL: 605 mg-Tris-base VORSICHT 4 g SDS VORSICHT 10 mg Serva blau G 12 g Glycerin PH-Wert auf 6,8 mit 1 M HCl, aliquoten anpassen und speichern bei-20 ° C VORSICHT Stapeln von gel Für 2 Gele: 400 µL Acrylamid VORSICHT 750 µL Gel Puffer 1,85 mL Reinstwasser 4 ΜL TEMED VORSICHT 20 µL 10 % APS (V/V) VORSICHT Hinzufügen von TEMED und 10 % APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels. Beide Chemikalien unter einer chemischen Haube verwendet werden. Gel zu lösen Für 2 Gele: 3,32 mL Acrylamid VORSICHT 3,35 mL Gel Puffer 1,14 mL Reinstwasser 2,12 mL 50 % Glycerin 6 ΜL TEMED VORSICHT 50 µL 10 % APS (w/V) VORSICHT Hinzufügen von TEMED und 10 % APS unmittelbar vor dem Gießen des Gels. Beide Chemikalien unter einer chemischen Haube verwendet werden. Wassergesättigten butanol 10 mL n-butanol VORSICHT 1 mL Reinstwasser Vorsicht: Finden Sie in der Materialtabelle für Leitlinien für die Verwendung von gefährlichen Chemikalien. Tabelle 1: Zusammensetzung der erforderlichen Lösungen. 1. Tri-Transfektion von Zellen HEK293T Hinweis: Die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen in das Protokoll finden Sie in Tabelle 1 .Hinweis: Leistung dieses Abschnitts des Protokolls dauert ungefähr 4 Tage. Tauen Sie ein Fläschchen mit menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293T Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c eingestelltHinweis: Verwenden Sie nur Zellen, die passagiert wurden weniger als 20 X, um optimale Transfektion Effizienz zu gewährleisten. Samen HEK293T Zellen bei einer Dichte von 2 x 103 , 6 x 103 Zellen/cm2 Zoll DMEM10 15 cm Durchmesser Zelle Kultur Gerichte. Wachsen Sie die Zellen zu 70 – 80 % Zusammenfluss in einem standard Inkubator bei 37 ° C, mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2eingestellt.Hinweis: Die Herstellung einer Charge von AAV-Vektoren unter Verwendung dieses Protokolls erfordert 18 Zelle Kultur Gerichte (15 cm Durchmesser). Ein Zelle Zusammenfluss von 70-80 % entspricht 6 x 103 , 7 x 103 Zellen/cm2, 17 – 20 ml Kulturmedium DMEM10 gepflegt. Bereiten Sie Polyethylenimine (PEI) / DNA-mix in einer Konzentration-Verhältnis von 1/3.5 (w/w). Bereiten Sie den DNA-Mix für 18 Zelle Kultur Gerichte in einem 50 mL konische Rohr durch Mischen 360 µg pΔF6, 180 µg pCapsid und 180 µg pTransgene in 18 mL 150 mM NaCl. Verteilen Sie die DNA-Mischung über drei 50 mL konische Röhrchen (6 mL DNA-mix pro konischem Rohr). Vorbereiten den PEI-Mix für sechs Kultur Gerichte in einem neuen 50 mL konische Röhrchen Zelle, durch das Mischen von 840 µg von PEI (1 µg/µL) in 6 mL 150 mM NaCl. Bereiten Sie den PEI/DNA-Mix durch Zugabe von 6 mL des PEI-Mix (in Schritt 1.4.3 vorbereitet vor), Tropfen für Tropfen, eines konischen Rohren mit der DNA-Mix (vorbereitet in Schritt 1.4.2) und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.Hinweis: Nach 20 min Inkubation werden die PEI/DNA-Mischung leicht trübe. Nehmen Sie 6 Zelle Kultur Gerichte aus dem Inkubator und aspirieren Sie komplett des Mediums aus jeder Kulturschale in einer Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Spuren des Mediums durch Spülen das Geschirr mit 5 mL vorgewärmte Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Sorgen Sie für die Verteilung des DPBS über die gesamte Oberfläche durch leichtes Kippen der Schale. Sanft aspirieren Sie des DPBS und 12 mL DMEM1 zu jedem Gericht.Hinweis: Vermeiden Sie lösen die Zellen indem das Medium langsam, aus einer Pipette am Rand des Tellers platziert. Mischen Sie die PEI/DNA durch Pipettieren nach oben und unten 3 x – 5 X. Fügen Sie 2 mL des PEI/DNA-Mix für jedes der sechs Zellen Kultur Gerichte in einem Tropfen für Tropfen-Mode, sorgfältig über die gesamte Fläche verteilen. Sobald jedes Gericht die Mischung hinzugefügt wird, legen Sie das Geschirr wieder in den Inkubator. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3– 1,8 für die verbleibenden Kultur-Gerichte. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 5 h bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2. Jede Kulturschale eine zusätzliche 12 mL DMEM10 hinzufügen, ohne das vorhandene Medium (mittlere Gesamtvolumen = 25 mL). Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bis zu 72 h nach Transfektion bei 37 ° C, mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Ergänzende Abbildung1: HEK 293T Zellmorphologie visualisiert durch Phasenkontrastmikroskopie (links) mit der Bestätigung der GFP Ausdruck visualisiert durch Fluoreszenz imaging (rechts). (A) erfolgreiche Transfektion von HEK293T Zellen mit einem GLP-Codierung pTransgene wird bestätigt durch Fluoreszenz-Bildgebung. (B) HEK293T Zellen behandelt ausschließlich mit Transfektion Reagenzien zeigen keine GFP Expression. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Das Medium und die Zellen 72 h nach Transfektion zu ernten. Verwenden Sie Zelle Schaber, um die Zellen von der Kulturschale sorgfältig zu trennen. Sammeln Sie das Medium und die Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen auf Eis gehalten.Hinweis: Der Inhalt der zwei Zelle Kultur Gerichte können in einem einzigen 50 mL konische Rohr gesammelt werden. Am Ende dieses Schrittes enthält jedes der neun Rohre ca. 50 mL des Mediums. Zentrifugieren Sie die konische Rohre bei 420 X g für 10 min bei 4 ° C mit der Beschleunigung und Verlangsamung der Zentrifuge auf Maximum festgelegt. Überstand aus jeder Tube sorgfältig zu verwerfen. Verwenden Sie die Pipetten nicht den Verlust des Materials zu verhindern. Stattdessen vorsichtig gießen Sie überstand in einen Container Entsorgung und die Röhrchen mit der Zelle Pellets zurück auf dem Eis. Aufzuwirbeln Sie jede Zelle Pellet in 2 mL Lyse-Puffer direkt in die 50 mL konische Rohr durch pipettieren und ab 5 – 10 X. Tun Sie nicht Wirbel. Pool-Lysaten aus drei Rohren zusammen.Hinweis: An dieser Stelle werden drei 50 mL konische Röhrchen, jeweils eine mit 6 mL resuspendierte Zellen Lyse Puffer. (2) AAV-Vektor-Reinigung Hinweis: Leistung von diesem Protokoll Abschnitt dauert ca. 1 Tag. Gleichzeitig führen Sie folgende Schritte auf jedem der drei 50 mL konische Rohre, enthalten die Zellen Nukleinsäuretablette Lyse Puffer (siehe die vorhergehende Note). Einfrieren und Auftauen der resuspendierte Zellen 3 X zu lösen Sie sie und lassen Sie die AAV-Partikel. Durchführen Sie den eiskalten Schritt, indem man die Rohre in einen Eimer mit Trockeneis gemischt mit Ethanol. Durchführen Sie, indem man sofort die Zellen in einem Wasserbad, eingestellt auf 37 ° c Auftauen Zentrifugieren Sie nach dem dritten Auftauen Schritt bei 1.167 X g für 15 min bei 4 ° C.Hinweis: Ein spürbarer Pellet bestehend aus Zellenrückstand wird gebildet. Beim Umgang mit der Rohren vermeiden Sie plötzliche Bewegungen, da diese die Ablösung des Geschosses in der Überstand verursachen können, die wodurch die Reinheit des letzten Vektors beeinträchtigt wird. Übertragen Sie sorgfältig die Überstände um 50 mL konische Rohre zu reinigen und dann jedes Rohr, um eine Endkonzentration von 50 U/mL überstand Nuklease hinzu. 30 min bei 37 ° c inkubieren Schwenken Sie die 50 mL konische Röhrchen eigenhändig alle 10 min um sicherzustellen, dass die Nuclease mit Überstand gut durchmischt ist. Klären des Überstands durch Zentrifugation bei 13.490 X g für 20 min bei 4 ° C. Eine 10 mL Spritze mit beimessen Sie 0,45 µm Filter, und legen Sie es auf eine saubere 50 mL konische Rohr. Vorsichtig entfernen Sie den Kolben zu und füllen Sie die Spritze mit der Überstand von Schritt 2.5. Verwenden Sie den Kolben durch den Filter der lysate erzwingen. Verwenden Sie einen neuen Filter und Spritze für jedes Rohr Überstand in Schritt 2.5 erhalten.Hinweis: Der erhaltene Teil wird als “Crude lysate” bezeichnet. Bereiten Sie jede der 15 %, 25 %, 40 % und 60 % Iodixanol Fraktionen in vier separate 50 mL konische Röhrchen, entsprechend den Anweisungen in Tabelle 1. Iodixanol Gradienten in drei Ultrazentrifugation Röhrchen mit der folgenden Reihenfolge der Iodixanol Brüche bereiten: 8 mL 15 % Iodixanol, 5,5 mL 25 % Iodixanol, 5 mL 40 % Iodixanol und 4,5 mL 60 % Iodixanol.Vorsicht: Iodixanol kann Irritationen der Augen, Haut und Magen-Darm- und Atemwegserkrankungen Traktate verursachen. Beim Umgang mit Iodixanol Gradienten Handschuhe tragen und arbeiten unter einem Laminar-Flow-Haube. Pipette 8 mL 15 % Iodixanol in jedes Rohr Ultrazentrifugation. Pipette 5,5 mL 25 % Iodixanol Lösung in ein sauberes 50 mL konische Röhrchen (Abbildung 1A). Verwenden Sie eine nicht graduierte Pasteurpipette (wie der Hals der Ultrazentrifugation Röhre zu schmal für konventionelle abgestufte Pipetten ist) sorgfältig Schicht 5,5 mL 25 % Iodixanol Lösung unter die 15 % Iodixanol Lösung (Abbildung 1 b).Hinweis: Dies können erfolgreich durch die Iodixanol in drei Schritten hinzufügen, da der Pasteurpipette nur etwa 2 mL aufnehmen kann. Fügen Sie die 40 % und 60 % Iodixanol Lösungen wie in Schritt 2.9.3 beschrieben. Stören Sie die verschiedenen Iodixanol Schnittstellen nicht, während Schichtung.Hinweis: Die richtige Vorbereitung der verschiedenen Iodixanol Fraktionen kann durch visuelle Bestätigung durch das Phenol rot hinzugefügt, um die Iodixanol Fraktionen (siehe Tabelle1) gewährleistet werden. Da jede Fraktion eine spezifische Dichte hat, sie werden nicht vermischen während der Schichtung Schritt, wenn sie richtig durchgeführt wird (siehe Abbildung 1). Zusätzlich zu den 15 % Iodixanol Gradienten mit einer Pasteurpipette lysate Rohöl Schicht. Gehen Sie Tropfen für Tropfen zu vermeiden, die Schnittstelle zwischen lysate Rohöl und Iodixanol Lösung zu stören. Füllen Sie die Ultrazentrifugation Röhre mit Lyse Puffer, bis der Meniskus die Röhre Halsansatz erreicht um sicherzustellen, dass der Schlauch nicht unter den sehr hohen Kräften erzeugt während der Ultrazentrifugation (Abbildung 1) zusammenbricht. Schließen Sie die Ultrazentrifugation Rohre mit entsprechenden Deckel. Verwenden Sie eine digitale Waage, um sicherzustellen, dass alle drei Ultrazentrifugation Röhren das gleiche Gewicht haben. Stellen Sie das Gewicht Bedarf durch Hinzufügen von mehr Lyse Puffer oben auf “Crude lysate”.Hinweis: Der Gewichtsunterschied zwischen den Rohren Ultrazentrifugation muss unter 0,1 g sein, den sicheren Betrieb der Ultrazentrifuge. Ultrazentrifugen sind potenziell gefährliche Teile der Ausrüstung und sollte nur von entsprechend geschultem Personal verwendet werden. Zentrifugieren Sie Schläuche am 301.580 X g, mit einem festen Winkel Titan Rotor für 1 h und 40 min bei 12 ° C, mit maximaler Geschwindigkeit, der Beschleunigung und Verzögerung. Legen Sie bei 40 % und 60 % Iodixanol Schnittstelle eine stumpfe Nadel aus rostfreiem Stahl. Legen Sie die Nadel auf einer 5 mL Spritze (Abbildung 1E). Aspirieren Sie nur der klare Anteil, mit den Vektor-Partikeln.Hinweis: Das Gesamtvolumen gesammelt ist ca. 2,5 bis 3 mL. Vermeiden Sie die Sammlung von Material aus der Schnittstelle 25 – 40 %, da dies den Grad der Kontamination im letzten Vektor Batch, wegen des Vorhandenseins der nicht wünschenswerten Proteine erhöhen wird. Verarbeiten Sie die gesammelten Bruchteil (Entsalzung und Konzentration) zu oder speichern Sie es über Nacht bei 4 ° C. Abbildung 1: Setup für Iodixanol gradient Reinigung und anschließende Vektor Sammlung. (A) vor dem Pipettieren der verschiedenen Iodixanol Gradienten in der Ultrazentrifugation Rohr, pipette eine angemessene Lautstärke der jeweiligen Iodixanol Lösung in einem separaten konischem Rohr. (B) dann verwenden Sie einen Pasteur pipette übertragen nacheinander jede Iodixanol Lösung auf die Ultrazentrifugation Röhre: Schichten von einer immer höheren Iodixanol Konzentration sollte am unteren Ende der Röhre unter der vorherigen Layer hinzugefügt werden. (C) Schicht der rohen Vektor lysate auf einmal die Steigung wurde vorbereitet. Dieses Vektorsystem Sammlung verwendet keine scharfen Nadeln, die ein Risiko von Nadelstichverletzungen “darstellen. (D) A Edelstahl 316-Spritze Nadel wird durch die Iodixanol Steigung bis zur 40 % / 60 % Iodixanol Schnittstelle eingefügt. (E) Vektor Partikel befinden sich in der 40 % Iodixanol Phase und werden gesammelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. (3) Entsalzung und Konzentration von der AAV-Vektor Hinweis: Leistung dieses Abschnitts des Protokolls dauert ca. 2 h. Prerinse Filtermembran zentrifugale Filter durch Zugabe von 5 mL 1 x PBS-MK und Zentrifuge für 5 min bei 4.000 X g. Geben Sie 5 mL 1 x PBS-MK auf die gesammelten AAV Vektor Bruchteil, mischen und fügen Sie dann das Gesamtvolumen des Filters. Nach Zugabe von 1 X PBS-MK, Trübung wird beobachtet. Zentrifuge bei 4.000 X g bis das Volumen auf den kegelförmigen Filter wurde auf 1 mL reduziert. Entsorgen Sie den Durchfluss in der äußeren Sammelröhrchen angesammelt. Fügen Sie 13 mL 1 x PBS-MK, die kegelförmige Filter und wiederholen Sie die Zentrifugation Schritt so oft wie nötig (mindestens 3 X), bis dort ist keine weitere Trübung beobachtet, wenn frische 1 X PBS-MK wird hinzugefügt. Waschen Sie im Finale Schritt zu, 13 mL PBS + 0,01 % (V/V) nicht-ionische Tenside und Zentrifuge bei 4.000 X g bis auf 300-350 µL die Lautstärke reduziert wird. Den verbleibenden Anteil vorhanden auf dem Filter zu sammeln, das gesamte Volumen zu einem sterilen geschürzten Microcentrifuge Schlauch pipettieren.Hinweis: Dieser Teil enthält den entsalzten und konzentrierte AAV-Vektor. In den folgenden Schritten dieses Protokolls ist dieser Anteil der “primäre” Bruch genannt. Achten Sie darauf, das Rohr unter der Haube zu behandeln und bei 4 ° c lagern Spülen Sie den Filter mit 200 µL 1 x PBS-MK, die restlichen Vektor Partikel auf dem Filter beibehalten zu sammeln. Sammeln Sie in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch.Hinweis: Dies ist eine verdünnte Vektor-Aktie, die für einige Anwendungen, bei denen geringere Vektor-Titer geeignet ist. In späteren Schritten ist dieser Anteil der “sekundären” Bruch genannt. Für eine kurzfristige Speicherung speichern Sie die Vektor-Fraktion(en) bei 4 ° C (weniger als 2 Wochen). Aliquoten und Store des Vektors bei-20 ° C bei längerer Lagerung erforderlich ist. Durchführen Sie Qualitätskontrollen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. 4. Titration des Vektors durch Quantitative Polymerase-Kettenreaktion Hinweis: Leistung dieses Abschnitts des Protokolls dauert ca. 3 h. Standardkurve Linearisieren Sie das Transgen exprimierenden Plasmid (pTransgene) für die Transfektion von HEK-293T Zellen in Abschnitt 1 verwendet. Bereiten Sie die Einschränkung Digest Mischung in einem 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch (siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung des Einschränkung-Digest-Mix).Hinweis: Passen Sie die Zusammensetzung der Beschränkung-Digest-Mix entsprechend das Enzym verwendet und die damit verbundenen Richtlinien des Herstellers. Inkubieren Sie die Einschränkung Digest Mischung für 1 h bei 37 ° c Überprüfen Sie die Effizienz der Verdauung durch Ausführen der linearisierten Plasmids auf einem 0,8 % (w/V) Agarose-Gel bei 100 V für 1 h. vollständige Verdauung des Plasmids Einschränkung ein einziges Fragment der definierte Größe produzieren sollte. Das lineare Plasmid DNA mit einem PCR-Reinigung-Kit des Herstellers Anweisungen24, nach reinigen und messen die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer durch Messung der Absorption bei 260 nm. Nach der Titration speichern Sie die restlichen Aliquote des linear Plasmids bei-20 ° C für die weitere Verwendung. Berechnen Sie wie folgt die Moleküle (d.h. DNA-Kopien) des Plasmids Bestandes pro Mikroliter. Berechnen Sie zunächst, das Molekulargewicht des Plasmids. Geht man davon aus, dass das durchschnittliche Gewicht eines DNA-Basenpaare (bp) 650 Dalton (Da ist) und dass ein Maulwurf eine bp 650 g wiegt, werden das Molekulargewicht von jedem doppelsträngige DNA Schablone abgeschätzt durch die Einnahme des Produkts von seiner Länge (in bp) und Gewicht pro Basenpaar.Plasmid Molmasse [g/Mol] = Plasmid Größe [bp] X 650 [Da/bp] Als Nächstes berechnen Sie die Anzahl der Mole von Plasmid pro Mikroliter.Mol Plasmid pro Mikroliter = Plasmid Konzentration [g/µL] / Plasmid Molmasse [g/Mol]Hinweis: Die Umkehrung des Molekulargewichtes ist die Anzahl der Mole des Plasmids in 1 g des Materials vorhanden. Dann berechnen Sie die Anzahl der Plasmid-Moleküle pro Mikroliter, Avogadro’s Zahl (6,022 x 1023 Moleküle/Mol).Moleküle des Plasmids pro Mikroliter = Mol Plasmid pro Mikroliter [Mol/µL] x Avogadro Zahl [Moleküle/Mol] Zu guter Letzt verdünnen Sie den Plasmid-bestand (Moleküle/µL) um ein 100 µL Lösung mit der gewünschten Konzentration von 1 x 109 Moleküle (Vektor Genome (Vg) pro Mikroliter) zu erhalten.Plasmid-Lager (100 µL) = (gewünschte Konzentration [Moleküle/µL] x 100 µL) / Plasmid Moleküle [Moleküle/µL] Stellen Sie serielle Verdünnungen der Plasmid-Aktie (1 x 109 Vg/µL) in Triplicates:10 µL 1 x 109 Vg/µL Plasmid Lager + 90 µL H2O = 1 x 10-8 -Vg/µL-Lösung10 µL 1 x 108 Vg/µL Verdünnung + 90 µL H2O = 1 x 107 Vg/µL Lösung10 µL 1 x 107 Vg/µL Verdünnung + 90 µL H2O = 1 x 106 Vg/µL Lösung10 µL 1 x 106 Vg/µL Verdünnung + 90 µL H2O = 1 x 105 Vg/µL-LösungWeiterhin eine 1 x 101 Vg/µL Lösung zu erhalten. Halten Sie die serielle Verdünnungen der standard Plasmid-Aktie auf Eis bis sie auf der qPCR-Platte (Ziffer 4.3) zu laden. Komponente Betrag 10 x Restriktionsenzym Puffer 5 ΜL Restriktionsenzym 2,5 ΜL Plasmid 5 µg H2O bis zu 50 µL Tabelle 2: Einschränkung Digest Mischen Zusammensetzung. Tabelle 3: Lager Plasmid Volumen Rechner. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. DNA-Extraktion aus dem AAV-Vektor Mix 2 µL der AAV Vektor-Lager (die primäre Fraktion aus Schritt 3.5) mit 198 µL DNase ich Puffer (1 X) in Streifen Röhren (PCR-Röhrchen) und fügen Sie 2 µL DNase ich.Hinweis: DNase ich genetisches Material abgebaut wird, das nicht in eine Vektor-Kapsid enthalten ist (die die qPCR Ergebnisse verzerren würde). Diese Lösung wird als Verdünnung “dil1 x 10-2″ bezeichnet. 30 min bei 37 ° C, gefolgt von 10 min bei 95 ° c inkubierenHinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt werden und das Material kann auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C gelagert werden um Produkt Verschlechterung zu vermeiden. Hinzu kommen 2 µL Proteinase K dil1 x 10-2 Lösung (Schritt 4.2.1) und 60 min bei 50 ° C, gefolgt von 20 min bei 95 ° c inkubierenHinweis: Dieser Schritt wird das AAV-Vektor-Kapsid zerlegen und Freisetzung des AAV-Vektor-Genoms in die Lösung. Fügen Sie Proteinase K im Übermaß, wie der Eiweißgehalt (Kapsid) der Probe ist nicht bekannt. Beachten Sie, dass es ist unbedingt darauf zu achten, dass alle Proteinase K-Aktivität durch Denaturierung vor qPCR, entfernt ist, um Probleme mit (Teil-) Polymerase Abbau beeinflussen das Endergebnis zu vermeiden. Bereiten Sie 01:10 serielle Verdünnungen der Proteinase K behandelt dil1 x 10-2 Lösung (Schritt 4.2.3) in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen wie folgt:10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL H2O = dil1 x 10-3 Verdünnung10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL H2O = dil1 x 10-4Verdünnung10 µL of dil1 x 10-4 + 90 µL H2O = dil1 x 10-5 Verdünnung Halten Sie die serielle Verdünnungen der DNA extrahiert aus dem Vektor auf Eis, bis sie auf der qPCR-Platte (Ziffer 4.3) zu laden. Titration von SYBR Green Erkennung basierende qPCR Vorbereiten der Probe und die Standards der qPCR-master-Mix in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie 10 µL SYBR Green Master Mix, 1 µL vorwärts Primer (10 µM bestand), 1 µL des rückwärts-Primer (10 µM bestand) und 3 µL von H2O pro Reaktion. Sehen Sie das Protokoll in Tabelle 4 für Primer-Sequenzen. Pipette qPCR-master-Mix rauf und runter, aber tun nicht Wirbel. Fügen Sie 15 µL der qPCR-master-Mix, gefolgt von entweder 5 µL der Standardkurve in Abschnitt 4.1 vorbereitet oder die DNA extrahiert aus dem AAV-Vektor in Abschnitt 4.2, in jede Vertiefung. Gehören Sie drei Brunnen, enthält nur die qPCR master-Mix, als Negativkontrolle. Finden Sie in Abbildung 2 die Platte Layout. Die Dichtplatte mit einer Dichtfolie und kurz Zentrifugieren die qPCR-Platte bei 1.500 X g für 30 s bei 4 ° C. Führen Sie die qPCR-Reaktion auf ein Platte-basierte Echtzeit-PCR-Amplifikation und Detektion Instrument, mit den Bedingungen, die in Tabelle 5vorgeschlagen. Primer-name Sequenz Forward primer 5′-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3 ” Rückwärts-primer 5′-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3 ” Tabelle 4: Primer-Sequenzen entwickelt, die gegenüber dem CBA-Veranstalter. Abbildung 2: Platte Layout für qPCR-basierte Vektor Titration. Die Proben sind farblich gekennzeichnet: grün = Standardkurve; blau = H2O Steuerung; grau = primäre Bruch; Orange = sekundäre Bruchteil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Schritt Zeit Temperatur Zyklen Ziel Vorinkubation 5 min 95 ° C x1 DNA-Denaturierung und Polymerase Aktivierung (hot Start-Reaktion). Verstärkung 10 min 95 ° C x1 Amplifikation der DNA. Einstellungen können optimiert werden, wenn alternative Primern mit verschiedenen Anlasstemperatur verwendet werden. 10 s 95 ° C x40 40 s 60 ° C 1 s 72 ° C Kühlung 10 s 40 ° C x1 Platte Kühlung. Ende der PCR. Tabelle 5: Thermische Radsport Protokoll für SYBR Green-basierte qPCR Titration. Datenanalyse zur Bestimmung der AAV-Vektor-titer Die Ct-Werte erhalten für die unterschiedlichen Verdünnungen der Standardprobe bereit in Abschnitt 4.1, eine Standardkurve generiert füllen Sie die Kalkulationstabelle Datenzellen (Tabelle 6A ein).Hinweis: Die Gleichung der Standardkurve wird angezeigt (y = eine ln (X) + b) zusammen mit der R-2 -Effizienz (Tabelle 6). Ein qPCR müssen einen Wirkungsgrad von nahezu 100 % und R2 in der Nähe von 1.0 (≥ 0,96). Verwenden Sie die berechneten Werte von a und b füllen Sie die entsprechenden Datenzellen in der Tabelle (Tabelle 6). Füllen Sie das Arbeitsblatt mit der Ct-Werte, die für die unterschiedlichen Verdünnungen der AAV-Probe in Abschnitt 4.2 vorbereitet. Berechnen Sie die durchschnittliche AAV Vektor Titer in Vektor Genomen pro Mikroliter der “primären Fraktion” mithilfe der folgenden Formel:Hinweis: der Faktor 400 ist für einzelne stranded Genome verwendet, während sc Genome einen Multiplikationsfaktor von 200 verwenden25. In der Tat, als DNA-Mengen bei jedem Zyklus qPCR doppelt erkannt sc, die DNA ist 2 X im Vergleich zu einem ss-Genom. Die Titration soll die Konzentration in Bezug auf Vektor Genome pro Mikroliter berechnen. Eine Korrektur ist notwendig für den Betrieb der qPCR Verwendung 2 µL des Ausgangsmaterials (Schritt 4.2.1). DIL vertritt die Verdünnungsfaktoren aus Schritt 4.2.4. Der Titer von den “sekundären” AAV Vektor Bruch (Schritt 3.6) kann gleichzeitig berechnet werden. Tabelle 6: Vorlage für qPCR Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. (5) Reinheitskontrolle von SDS-PAGE und silberne Färbung Hinweis: Leistung dieses Abschnitts des Protokolls dauert ca. 5 h. Verwenden Sie 70 % (V/V) Ethanol, um gründlich zu reinigen, die Glasplatten verwendet für das Gießen der Gele. Montieren des Gießsystems Gel. Stellen Sie sicher, dass die Böden der Glasplatten nicht gechipt sind, um Austreten von Acrylamid-Mischung zu vermeiden, wenn das Gel casting. Bereiten Sie das Stapeln und die Lösung von Gel-Lösungen in zwei separaten 50 mL konische Röhrchen. Verzichten Sie auf Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS), sind verantwortlich für die Polymerisation des Gels. Fügen sie unmittelbar vor dem Gießen des Gels.Hinweis: Die endgültige Prozentsatz von Acrylamid in das Gel beeinflusst das Profil der Trennung der Proteine: in der Regel eine Endkonzentration von 10 % (V/V) von Acrylamid wird ausreichen, um die Reinheit einer AAV-Vektor-Zubereitung zu testen. Mischen Sie sanft durch das Röhrchen mit der Gel-Komponenten umschwenken. Tun Sie nicht Wirbel, da übermäßige Sauerstoffzufuhr Polymerisation beeinträchtigen kann. Fügen Sie TEMED und 10 % (w/V) APS auf die Lösung von Gel-Lösung. Mischen Sie und gießen Sie dann in den Gel-Halter, bis sie ca. 1-2 cm unterhalb der Oberkante der kleine Glasplatte erreicht. Legen Sie eine Schicht von wassergesättigten Butanol auf der Oberseite der Acrylamid-Mischung. Dadurch wird die Bildung von einer flachen Oberfläche während der Polymerisation sichergestellt. Lassen Sie das Gel unter Alkohol länger als 30 min nicht, da wird das Gel zu entwässern und ihre Funktion beeinträchtigen.Achtung: Butanol ist gefährlich bei Hautkontakt. Darüber hinaus stellt eine Brandgefahr. Mit Vorsicht handhaben. Warten Sie, bis das Gel zu polymerisieren und dann abgießen die Butanol. Tipp: Überprüfen Sie, ob die überschüssige Gel Mischung in der Röhre verfestigt hat. Polymerisation tritt in weniger als 20 min. Waschen der Oberfläche des Gels mit H2O und dann trocknen Sie es mit Papiertüchern, kümmert sich nicht um die Oberfläche des Gels zu stören. TEMED und 10 % (w/V) APS zu stapelnden Gels und gießen Sie das Gel in den Gel-Halter auf das Trennende Gel. Legen Sie den mitgelieferten Kamm in das Gel. Führen Sie diese Aktion mit einer stetigen Bewegung um die Bildung von Luftblasen in den Brunnen zu vermeiden. Warten Sie mindestens 20 Minuten für das Gel zu polymerisieren. Tipp: Prüfen Sie, wenn das überschüssige Gel in mischen das konische Rohr verfestigt hat. Bereiten die beiden Mischungen (Tabelle 7) für die primäre und die sekundäre AAV–Fraktionen Vektor (Schritte 3.5 und 3.6). Hohen Anteil Geringe Menge AAV-Vektor-Lager 5 ΜL 1 ΜL 5 x Probenpuffer 3 ΜL 3 ΜL H2O 7 ΜL 11 ΜL Tabelle 7: Zusammensetzung der Probemischungen erforderlich für silberne Färbung. Denaturieren Sie voll die Probemischungen durch Erhitzen sie für 5 min bei 95 ° C. Montieren Sie die Elektrophorese-Tank, Aufmerksamkeit auf die Elektrode Ausrichtung. Füllen Sie den Tank mit 1 x Kathode Puffer auf der Innenseite der die Elektrodenanordnung und 1 x Anode Puffer auf der Außenseite.Hinweis: Anode Puffer von Ausführung zu Ausführung verwertbar. Frische Kathode Puffer muss immer verwendet werden. Den Kamm aus dem Gel entfernen und Reinigen der Brunnen des Gels mit 1 X Kathode Puffer. 1 µL Protein-Leiter in einem Brunnen zu laden. Laden Sie die Probemischungen in verschiedenen Brunnen auf dem gleichen Gel (Abbildung 3). Führen Sie das Gel bei 50 V, bis die Proben geben Sie die Lösung von Gel. Dann erhöhen Sie die Spannung bis 100 V, bis die Farbstoff-Front die Untergrenze des Gels erreicht. Extrahieren Sie das Gel sorgfältig aus Glasplatten und verwenden Sie die silberne Färbung Kit (laut des Herstellers Anweisungen26) zur Visualisierung der viralen Proteine (VP1, VP2 und VP3 Untereinheiten), aus die das Kapsid AAV, sowie besteht für mögliche zu überprüfen Protein-Kontamination (Abbildung 3). Abbildung 3: Bewertung der Vektor Reinheit mittels SDS-PAGE und silberne Färbung. Mit einem Tricine-SDS-Gel, 5 µL der verschiedenen Vektor Vorbereitungen wurden getrennt. Proteine wurden anschließend durch silberne Färbung festgestellt. Vektoren werden als reine wann VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) und VP3 (60 kDa) sind sichtbar in einem 1:1:10 Verhältnis (Spur 1), ohne übermäßige Hintergrund (Bahn 2) oder unspezifische Bänder (Spur 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Representative Results

AAV9 galt bis vor kurzem die effektivste AAV Vektor Serotyp überqueren die BBB und transducing Zellen des ZNS, nach peripheren Gabe sein. Ein wichtiger Fortschritt im Kapsid Design wurde erreicht bei Deverman Et Al. berichtet ein Kapsid-Auswahl-Methode namens Cre Rekombination basierende AAV-bezogene Entwicklung (CREATE)17. Mit dieser Methode identifiziert sie eine neue Kapsid, PHP benannt. B, die sie in der Lage, die Mehrheit der Astrozyten und Neuronen in mehreren CNS Regionen nach systemische Injektion17transduzieren ausgewiesen. Es sollte an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass auch wenn PHP. B liefert positive Ergebnisse bei C57/Bl6 Mäusen (die der Stamm in der ersten Isolierung Experimente verwendet wurde), vorläufige Berichte deuten darauf hin, dass seine Effizienz in einem Stamm-abhängigen Weise variieren. Weitere Experimente werden, kein Zweifel, mehr Licht auf diese Frage31. Doch trotz dieser Probleme, PHP. B bietet spannende Möglichkeiten für nicht-invasive Genmanipulation im ZNS von Mäusen, einschließlich Beweis-vonkonzept Gen Therapie Experimente in Krankheitsmodellen. Als solche haben wir die Effizienz der Transgen-Ausdruck mit Hilfe von PHP zu bewerten. B im Vergleich zu AAV9, die der “Goldstandard” Vektor für CNS Transduktion nach peripheren Gabe seit 20092wurde. Um einen direkten Vergleich der beiden Serotypen, unter optimalen Bedingungen für Transgene Ausdruck durchführen haben wir ein sc Genom Konfiguration32verwendet. Beide Vektoren durchgeführt das Transgen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle des Veranstalters allgegenwärtigen Huhn β-Aktin (CBA). Weibliche C57/Bl6 Mäuse an postnatalen Tag 42 (Gewicht ca. 20 g) erhalten eine Dosis von 1 x 1012 Vg per Mausklick entweder scAAV2/PHP. B-CBA-GFP oder scAAV2/9-CBA-GFP. Vektor-Verwaltung wurde durchgeführt über Heck Vene Injektion. Die Experimente wurden von der Ethikkommission der KU Leuven genehmigt. Drei Wochen Steroidtherapie, unterzog sich die Mäuse Transcardial Perfusion mit eiskaltem PBS, gefolgt von 4 % (w/V) eiskalte Paraformaldehyd (PFA). Ihre Gehirne wurden geerntet und weitere Postfixation durch eine Übernachtung Inkubation in der gleichen Fixiermittel vor der Übertragung auf 0,01 % (w/V) Na-Azid/PBS für die Lagerung bis zur weiteren Analyse unterzogen. Danach die Gehirne wurden mit Hilfe einer vibrierenden Mikrotom geschnitten und Immunohistochemistry wurde auf 50 µm dicke Schichten durchgeführt. Um die Höhe der Transgen-Expression zu bewerten, wurden Abschnitte mit primären Antikörper gegen GFP (Kaninchen Anti-GFP), gebeizt, mit Erkennung mit sekundären Antikörper konjugiert zu einem Fluoreszenzfarbstoff (Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488) (Abbildung 4A, B ). Fluoreszenz-Intensität-Messungen (in beliebigen Einheiten [au]) bestätigt eine deutliche Zunahme der GFP-Ausdruck, wenn ein sc Genom und PHP. B-Kapsid dienten im Vergleich zu AAV9. Beobachtet wurden Erhöhungen der GFP in das Großhirn (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), das Kleinhirn (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), und dem Hirnstamm (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Abbildung 4). Abbildung 4: systemische Lieferung von scAAV2/PHP. B-CBA-GFP führt zu einer hohen GFP Ausdruck im ZNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP oder scAAV2/9-CBA-GLP (1 x 1012 Vg/Maus) war 6 Wochen alten C57/Bl6 Mäuse über Heck Vene Injektion verabreicht. GFP wurde mit Immunohistochemistry auf koronalen Gehirn Abschnitte 3 Wochen Steroidtherapie nachgewiesen. (A) das Großhirn und (B) das Kleinhirn und der Hirnstamm gezeigt. Skalieren von Balken = 1 mm. (C) die Quantifizierung der relativen Fluoreszenz Intensität durchgeführt wurde, um festzustellen, das Niveau der GFP Signal mit jeder Vektor (10 Teile pro Maus; drei Mäuse pro Schaltgruppe) erreicht. Ein One-Way ANOVA durchgeführt wurde, gefolgt von einem zweiseitigen Student t-test; die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; p < 0,01; Au. willkürliche Einheiten. pCapsid, verwendet für AAV-Vektor-Produktion, enthält gen Rep vom Serotyp 2 und die gen- Kappe vom Serotyp PHP. B oder AAV9, entsprechend. Diese Zahl wurde von Rincon geändert Et Al.32. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren beschrieben hier verwendet Materialien und Ausrüstung für die meisten molekularbiologischen Labors und Zelle-Kultur-Einrichtungen. Es ermöglicht dem Benutzer rein, präklinische Grade AAV-Vektoren zu erhalten, die auf mehrere Arten von Zellen und Gewebe in einem Spektrum von in Vitro und in Vivo Anwendungen verwendet werden kann. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls, im Vergleich zu anderen (d. h. CsCl-basierte Reinigung), ist die kürzere Arbeitszeit benötigt. Ready-to-Use-AAV-Vektoren sind erhältlich in maximal 6 Werktagen nach der anfänglichen Transfektion von HEK293T Zellen.

Mehrere Faktoren können die endgültige Rendite oder die Qualität des AAV Vektors negativ beeinflussen. Armen Transfection Leistungsfähigkeit ist einer der Hauptgründe für eine geringe virale Ausbeute33. Eine wichtige Empfehlung ist die Verwendung von HEK293T Zellen, die haben nicht mehr als 20 mal passagiert gewesen und haben keinen Zelle Zusammenfluss größer als 90 % zum Zeitpunkt der Transfektion21. Darüber hinaus hat die Transfektion Methode ausgewählt einen großen Einfluss auf die Ergebnisse. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von PEI. PEI ist ein kationisches Polymer mit der Lieferfähigkeit exogenen DNA in den Zellkern durch die Erzeugung von komplexen Polymer und Nukleinsäure, bekannt als Polyplexes, die durch die Zelle und verschleppte über Endosomen34aufgegriffen werden. PEI-basierte Transfektion ist einfach und schnell durchzuführen, im Gegensatz zu anderen weit verbreiteten Methoden wie die Co Fällung von DNA mit Calcium-Phosphat-35. PEI-basierte Transfektion ist auch viel billiger im Vergleich zu anderen neu eingeführten Methoden, z. B. die Verwendung von kationischen Lipiden und Magnet-vermittelte Transfektion36.

Die Reinigung-Strategie spielt eine Schlüsselrolle im Protokoll. Im Vergleich zu anderen Methoden, tendenziell Iodixanol-basierte Reinigungen einen höheren Anteil an leeren Viruspartikel (20 %)20enthalten. Dies ist, zu einem gewissen Grad dadurch kompensiert, dass Iodixanol-basierte Reinigung routinemäßig AAV Vektor Vorbereitungen mit einem Partikel-Infektiosität-Verhältnis von weniger als 100 ergibt. Dies bedeutet eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zu herkömmlichen CsCl-basierte Verfahren, für die erheblichen Verlust des Partikels Infektiosität gemeldeten37ist. Eine weitere gemeinsame alternative Methode zur AAV-Vektoren zu reinigen ist die Chromatographie-basierte Reinigung. Diese Methode hat jedoch den großen Nachteil, die eine bestimmte Spalte benötigt für jeden Vektor Kapsid verwendet wird: zum Beispiel während AAV2 klassisch mit Heparin Spalten isoliert ist, diese Methode funktioniert nicht mit AAV4 und AAV5, die keine Heparin-bindende besitzen Seiten auf ihre Capsids38. Wenn man bedenkt, dass Chromatographie Reinigung auch teuer ist, ist Iodixanol-basierte Reinigung in der Regel besser geeignet für Laboratorien, die wollen qualitativ hochwertigen Chargen der AAV-Vektoren auf einem kleinen Maßstab33,39, 40. jedoch um die letzte Ausbeute und Reinheit des Vektors zu maximieren, äußerste Sorgfalt ist erforderlich, wenn die Iodixanol Steigungen machen. Die verschiedenen Fraktionen Iodixanol sollte der Ultrazentrifugation Röhre mit einer sterilen Pasteurpipette, dessen Spitze die Wand des Rohres berührt, übertragen werden: Iodixanol sollte aus der Pipette ausgestoßen werden, langsam und kontinuierlich. Wie die Vektor-Partikel in der 40 % Iodixanol Schicht ansammeln, muss sorgfältig darauf zu achten, dass der Gradienten Schnittstellen nicht20mischen. Zu guter Letzt sollte die Fraktion mit den Vektor durch die Einfügung einer Edelstahl-stumpfen Nadel mit einem Messgerät nicht größer als 20 G. wiederhergestellt werden Zur Maximierung der Vektor Erholung soll der klaren Bruch in seiner Gesamtheit abgerufen werden. Während dieses Schrittes ist das Timing entscheidend. Um zu vermeiden, beeinträchtigen die Reinheit des Präparats, gilt es, die Sammlung zu stoppen, bevor andere (Verunreinigungen) Phasen des Verlaufs gesammelt werden.

Unterschiede in den erhaltenen Vektor-Titer können die intrinsische Fähigkeit des Vektors, verpackte Teilchen erzeugen auch zugeschrieben werden. Ein Vergleich zwischen verschiedenen AAV Serotypen hat gezeigt, dass einige AAV-Vektoren sind schwieriger zu einem höheren Titer als andere (z. B. AAV2) produzieren41. Niederschlag des Vektors, während der Entsalzung Schritt kann ein möglicher Grund für eine niedrigere Titer und leicht durch die Vermeidung von Überkonzentration33verhindert. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass die Effizienz der Iodixanol Gradient basierende Reinigung leicht zwischen Serotypen unterscheidet und daher Abweichungen in der Titer mit verschiedenen Serotypen erhalten41beobachtet werden.

Schließlich muss darauf hingewiesen werden, dass obwohl qPCR ein sehr genaues Verfahren zur DNA-Quantifizierung ist einige inhärente Variabilität in der Technik beobachtet werden kann. Genauigkeit bei der Titration ist in erster Linie abhängig von präzises pipettieren und ordnungsgemäße vortexen aller Lösungen. Um die genauesten Titer lesen zu gewährleisten, kann die qPCR selbstständig wiederholt werden, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Wahl der Primer präsentiert in diesem Protokoll basiert auf der Reihenfolge der CBA-Promotors befindet sich in der pTransgene-Plasmid in unserem Labor verwendet. Der CBA-Promoter ist ein starke synthetische Förderer, die in das Vektorfeld auf Laufwerk Ausdruck über mehrere Zelltypen verbreitet ist. Es enthält mehrere Elemente, einschließlich das Cytomegalovirus (CMV) frühen Enhancer-Element; der Projektträger, ersten Exon und die ersten Intron des CBA-Gens; und den Spleiß-Akzeptor des Kaninchen-β-Globin-Gens. Jedoch können Primer für nahezu jedes Element innerhalb der Expressionskassette (einschließlich der Projektträger, Transgen und regulatorische Elemente) ausgelegt werden. Der Vergleich der Titer in Chargen ist auch möglich, die Primer gegen Regionen üblich, die betreffenden Vektoren eingesetzt werden.

Abschließend kann dieses Protokoll verwendet werden, um AAV-Vektoren mit einer Vielzahl von Capsids, Genom-Konfigurationen, Projektträger Typen und Transgen Ladungen zu produzieren. Dies ermöglicht Benutzern die endgültigen Eigenschaften ihrer Vektoren zu experimentellen Anforderungen am besten entsprechen anpassen. Im Beispiel in die repräsentativen Ergebnisse präsentiert die Verwendung von PHP. B Kapsid, die effizient die BBB kreuzt, gab hocheffiziente Genexpression im ZNS, folgende Rute Vene Injektion32. Die systemische Gabe von CNS Durchdringungsmittel Vektoren hat erhebliche Vorteile in Bezug auf mögliche Nebenwirkungen2,17,32. Eine mögliche Alternative zur peripheren Injektion unter Vermeidung der Vorbehalte der invasiven Techniken ist intrathekale Lieferung, bestehend aus Lieferung von der AAV-Vektor in die cerebrospinale Flüssigkeit. Diese Tour ist als wirksam erwiesen, weit verbreitete Ausdruck des Transgens über ZNS, weniger Ziel Wirkungen in peripheren Organe und geringe Immunantwort42zeigen. Jedoch sind intrathekale Injektion viel schwieriger, da sie höhere technische Fähigkeiten als Rute Vene Injektion erfordern.

Die Chancen für AAV Vektor Gen-Therapie-Anwendungen werden Kapsid Weiterentwicklung dieser Technologie verfeinern angetrieben. Solche Ansätze bieten attraktive Möglichkeiten zur Behandlung von unheilbarer CNS-Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Parkinson und Alzheimer-Krankheit18.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.r. stützt sich auf einen Fonds Voor Wetenschappelijk verwendet Vlaanderen (FWO) postdoctoral Fellowship (133722/1204517N) und die kontinuierliche Unterstützung der Fundación Herz-Kreislauf-de Colombia und die Administrative Abteilung Wissenschaft anerkennt, Technologie und Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projekt-Code 656671250485). M.M. wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium FWO (1S48018N). M.G.H. wurde durch eine institutionelle Förderung VIB und externe Unterstützung von Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), die Stiftung für Alzheimer-Forschung (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) und der European Research Council (ERC) (Starting Grant unterstützt. 281961 – AstroFunc; Nachweis der Concept Grant 713755 – AD-VIP). Die Autoren erkennen Jeason Haughton für seine Hilfe bei Maus Tierhaltung, Stephanie Castaldo für ihre Hilfe die Rute Vene Injektionen durchführen und Caroline Eykens für die Bereitstellung der Bilder von transfizierten Zellen HEK293T. M.G.H. räumt Michael Dunlop, Peter Hickman und Dean Harrison.

Materials

Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100X) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic System 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37°C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml
Co2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 5 ml, 10 ml and 25 ml
Filter tips * Greiner bio-one 750257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 738257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Filter tips * Greiner bio-one 771257 2 µl, 20 µl, 200 µl
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F144801
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123600
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123615
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123601
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.
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References

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Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).
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