Summary

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Published: February 12, 2019
doi:

Summary

Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.

Abstract

Radiactivos de Pulso-persiga el etiquetado es una poderosa herramienta para el estudio de la maduración conformacional, el transporte y su localización celular funcional, la degradación de las proteínas de la blanco en células vivas. Mediante el uso de tiempos radiolabeling cortos (pulso) (< 30 min) y firmemente controlada por tiempos de persecución, es posible que sólo una pequeña fracción de la piscina de la proteína total de la etiqueta y seguir su plegamiento. Cuando se combina con nonreducing, reduciendo electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la inmunoprecipitación con anticuerpos (específicos de conformación), procesos de plegamiento puede examinarse con gran detalle. Este sistema se ha utilizado para analizar el plegado de proteínas con una gran variación de propiedades como proteínas solubles, proteínas transmembranales únicas y de multipaso, pesadamente proteínas N – y O-glicosiladas y proteínas con y sin extenso disulfuro de la vinculación. Pulso-persiga los métodos son la base de estudios cinéticos en una gama de características adicionales, incluyendo co – modificaciones del posttranslational, Oligomerización y polimerización, esencialmente, lo que permite el análisis de una proteína desde el nacimiento hasta la muerte. Pulso-persiga los estudios en el plegamiento de la proteína son complementarios con otros métodos bioquímicos y biofísicos para el estudio de proteínas en vitro proporcionando información fisiológica y mayor resolución temporal. Los métodos como se describe en este artículo se adaptan fácilmente para estudiar el plegamiento de casi cualquier proteína que puede expresarse en sistemas mamíferos o insectos-cell.

Introduction

El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes1. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.

El metabólico etiquetado de proteínas durante un pulso corto con 35S-labeled metionina/cisteína, seguido de una persecución en la ausencia de una etiqueta radiactiva, permite el seguimiento específico de una población de proteínas recién sintetizadas en el más amplio medio celular. Luego, las proteínas blanco pueden ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizan por SDS-PAGE u otras técnicas. Para muchas proteínas, su viaje a través de la célula se caracteriza por modificaciones visibles en gel de SDS-PAGE. Por ejemplo, el transporte de proteínas glicosiladas desde el retículo endoplásmico (ER) del complejo de Golgi es acompañado a menudo por modificaciones de glycans N-ligados o la adición de O-linked glycans2,3. Estas modificaciones provocan grandes aumentos en la masa molecular aparente, que puede verse por los cambios de movilidad en SDS-PAGE. Maduración también puede ser marcada por las divisiones proteolíticas, tales como péptido señal escote o la eliminación de pro-péptidos, dando por resultado cambios en la masa molecular aparente que puede seguirse fácilmente en gel de SDS-PAGE4. Radiactividad tiene considerables ventajas sobre técnicas comparables como persecuciones de cicloheximida, donde se impide la síntesis de nuevas proteínas, como tratamientos más largos son tóxicos para las células y no excluyen a la mayoría de las proteínas mayores, estado de la Análisis, como algunas proteínas tienen vidas medias de días. La comparación de proteínas en ambos nonreducing y reducción de condiciones permite el análisis de la formación del enlace de disulfuro, un paso importante en el plegamiento de las proteínas secretoras muchos de4,5,6, 7.

Aquí describimos un método general para el análisis del plegamiento de la proteína y el transporte en las células intactas, utilizando un enfoque de Pulso-persiga radiactivos. Mientras que nos hemos dirigido para proporcionar el método detallado como sea posible, el protocolo tiene un potencial casi ilimitado para la adaptabilidad y permitirá la optimización para el estudio de proteínas específicas de cada lector.

Se proporcionan dos protocolos alternativos Pulso-persiga, para células adherentes (paso 1.1 del protocolo presentado aquí) y las células de suspensión (paso 1.2 del protocolo presentado aquí). Las condiciones proporcionan aquí son suficientes para visualizar una proteína expresada con niveles de media a alta expresión. Si el lector está trabajando con proteínas mal expresadas o varias condiciones posttreatment, tales como múltiples immunoprecipitations, es necesario aumentar el tamaño del plato o número de células adecuado.

Para la persecución de pulso de suspensión, las muestras de chase tomadas en cada momento se toman de un solo tubo de células. Los pasos de lavado después de que el pulso se omiten; en cambio, más incorporación de 35S es prevenida por dilución con un alto exceso de cisteína y metionina sin etiqueta.

Los protocolos presentados usan radiactivos 35S etiquetado cisteina y metionina para seguir procesos de plegamiento de proteínas celulares. Todas las operaciones con reactivos radiactivos deben realizarse utilizando medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo cualquier exposición del operador y el medio ambiente a la radiación radiactiva y realizarse en un laboratorio designado. Pulso-persiga etiquetado técnica es relativamente ineficaz en tiempos de pulso corto (< 15 min), menos del 1% de la cantidad a partir de la radiactividad se incorpora en las proteínas recién sintetizadas. Después el enriquecimiento de la proteína mediante inmunoprecipitación de blanco, la muestra para SDS-PAGE contiene menos de 0.05% de la cantidad inicial de radiactividad.

Aunque los 35S metionina y cisteína etiquetado mezcla se estabiliza, se producirá cierta descomposición, produciendo compuestos radiactivos. Para proteger el investigador y el aparato, se deben tomar algunas precauciones. El investigador siempre debe obedecer a las normas de seguridad de radiación local y puede llevar carbón y una máscara, además de una bata de laboratorio y guantes (doble) de enfermería. Los frascos de stock con 35S metionina y cisteína siempre deben abrirse en una campana de humos, o bajo un punto de aspiración local. Puntos de contaminación de laboratorio conocidas son centrífugas, pipetas, baños, incubadoras y agitadores. La contaminación de estas áreas se reduce mediante el uso de puntas de pipeta con filtro de carbón, tubos de microcentrífuga de sello positivo (véase Tabla de materiales), esponjas de carbón de acuario de agua baños, carbón filtro papeles pegados en los platos de Pulso-persiga, protector de carbón en el sistema de aspiración y la colocación de platos que contienen carbón granos en incubadoras y recipientes de almacenamiento.

Protocol

Todos los procedimientos y reactivos radiactivos se manejaron con arreglo a las normas y reglas locales de radiación de la Universidad de Utrecht. 1. pulso Chase Pulso Chase para células adherentesNota: Los volúmenes dados aquí se basan en platos de cultivo celular 60 mm. Para 35 mm o 100 mm platos, multiplicar los volúmenes por 1/2 o 2, respectivamente. Este protocolo utiliza un tiempo de pulso de tiempos de 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min 10 min y chase. Est…

Representative Results

El plegamiento y la secreción de la gp120 del VIH-1 de una persecución de pulso adherente se muestra en la figura 2. El gel nonreducing (Nº de células en la figura) muestra el plegamiento oxidativo de gp120. Inmediatamente después del pulso de etiquetado de gp120 de 5 min (min 0 chase) aparece como una banda difusa en el gel, y conforme avanza la persecución, la banda migra por el gel a través de la aún más difundida plegamiento intermedios (IT) hast…

Discussion

Pulso-persiga métodos han sido esenciales para el desarrollo de la comprensión de los científicos del plegamiento en las células intactas de la proteína. Mientras que hemos intentado ofrecer un método que es tan general como sea posible, este enfoque tiene el potencial de las variaciones casi ilimitadas estudiar varios procesos que ocurren durante el plegamiento, el transporte y la vida de las proteínas dentro de la célula.

Cuando se realiza una persecución de pulso utilizando célula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores gracias a todos los miembros del laboratorio Braakman, pasado y presentan, para sus discusiones fructíferas y ayudan en el desarrollo de los métodos presentados en este artículo. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en séptimo programa marco (FP7/2007-2013) N ° de la Unión 235649 y la organización de países bajos de investigación científica (NWO) bajo el eco-programa N ° 711.012.008.

Materials

1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20×25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
HEPES Sigma H4034 Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

References

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McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

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