Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour une méthode de chasse générale qui permet l’analyse cinétique de pliage, le transport et la dégradation des protéines qui doivent être suivies dans des cellules vivantes.
Abstract
Marquage radioactif pulse-chase est un outil puissant pour l’étude de la maturation conformationnelle, le transport vers leur localisation cellulaire fonctionnelle et la dégradation des protéines cibles dans des cellules vivantes. En utilisant les radiolabeling temps courts (impulsion) (< 30 min) et étroitement contrôlé fois chase, il est possible d’étiqueter seulement une petite fraction de la piscine de protéines totales et suivre son pliage. Lorsqu’il est combiné avec non-réducteurs/réduire l’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunoprécipitation avec des anticorps (conformation spécifique), processus de pliage peut être examiné en détail. Ce système a été utilisé pour analyser le repliement des protéines avec une énorme variation de propriétés telles que des protéines solubles, des protéines transmembranaires simples et multi-pass, fortement protéines N – et O-glycosylées et des protéines avec ou sans une vaste disulfure collage. Méthodes de chasse sont à la base des études cinétiques dans une gamme de fonctionnalités supplémentaires, notamment des co – et des modifications post-traductionnelles oligomérisation et polymérisation, essentiellement en permettant l’analyse d’une protéine de la naissance à la mort. Études de Pulse-chase sur le repliement des protéines sont complémentaires avec d’autres méthodes biochimiques et biophysiques pour l’étude des protéines in vitro en offrant une résolution temporelle accrue et des informations physiologiques. Les méthodes décrites dans cet article sont facilement adaptés pour étudier le repliement des presque toute protéine qui peut être exprimé dans les systèmes de mammifères ou des insectes-cellule.
Introduction
Le repliement des protéines de même relativement simple implique plusieurs différentes enzymes pliants, chaperons moléculaires et modifications covalentes1. Une reconstitution complète de ces processus in vitro est pratiquement impossible, étant donné le grand nombre de différents composants impliqués. Par conséquent, il est hautement souhaitable, pour étudier le repliement in vivo, dans des cellules vivantes des protéines. Techniques de chasse radioactifs s’avérer un outil puissant pour l’étude de la synthèse, pliage, transport et la dégradation des protéines dans leur environnement naturel.
Le métabolisme d’étiquetage de protéines au cours d’une brève impulsion avec 35S-labeled méthionine/cystéine, suivie d’une course-poursuite en l’absence d’un marqueur radioactif, permet un suivi spécifique d’une population de protéines nouvellement synthétisées dans le milieu cellulaire la plus large. Ensuite les protéines cibles peuvent être isolée par immunoprécipitation et analysés par SDS-PAGE ou autres techniques. Pour beaucoup de protéines, leur périple à travers la cellule est marquée par des modifications visibles sur gel SDS-PAGE. Par exemple, le transport des protéines glycosylées du réticulum endoplasmique (ER) à l’appareil de Golgi est souvent accompagné par des modifications de N-glycanes ou l’addition de O-glycanes2,3. Ces modifications provoquent des augmentations importantes dans la masse moléculaire apparente, qui peut être vu par les changements de mobilité en SDS-PAGE. Maturation peut également être marquée par des clivages protéolytiques, tels que le clivage du peptide signal ou l’enlèvement de pro-peptides, entraînant des changements dans la masse moléculaire apparente que l’on peut suivre facilement sur de gel SDS-PAGE4. La radioactivité a des avantages considérables sur des techniques comparables tels que les poursuites de cycloheximide, où elle empêche la synthèse de nouvelles protéines, comme les traitements plus longs sont toxiques pour les cellules et n’excluent pas la majorité des protéines âgées, équilibre de la analyse, que certaines protéines ont des demi-vies de jours. La comparaison des protéines sous les deux non réductrice et conditions réductrices permet l’analyse de formation de la liaison disulfure, une étape importante dans le pliage de nombreuses protéines sécrétoires4,5,6, 7.
Nous décrivons ici une méthode générale d’analyse de repliement des protéines et de transport dans les cellules intactes, en utilisant une approche radioactifs pulse-chase. Alors que nous avons visant à assurer l’application de la méthode détaillée que possible, le protocole a un potentiel presque illimité pour adaptabilité et permettra l’optimisation pour l’étude des protéines spécifiques de chaque lecteur.
Deux protocoles alternatifs pulse-chase, un pour les cellules adhérentes (étape 1.1 du protocole présenté ici) et l’autre pour les cellules en suspension (étape 1.2 du protocole présenté ici) sont fournis. Les conditions prévues ici suffisent visualiser une protéine exprimée avec moyen – à haut-niveau d’expression. Si le lecteur ne fonctionne pas avec les protéines mal exprimées ou diverses conditions après le traitement, comme plusieurs d’immunoprécipitation, il est nécessaire d’augmenter la taille du plat ou le nombre de cellules de façon appropriée.
Pour chase de suspension de pouls, les échantillons de chase prélevés à chaque instant sont tirées d’un seul tube de cellules. Les étapes de lavage après l’impulsion sont omises ; au lieu de cela, plus l’incorporation de 35S est empêchée par dilution avec un excès élevé de non étiqueté méthionine et la cystéine.
Les protocoles présentés utilisent radioactifs 35S-labeled cystéine et méthionine pour suivre le processus de repliement des protéines cellulaires. Toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l’aide de mesures de protection appropriées afin de minimiser toute exposition de l’opérateur et l’environnement aux rayonnements radioactifs et être effectuée dans un laboratoire désigné. Comme le pulse-chase étiquetage technique est relativement inefficace en temps de pulsation courte (< 15 min), moins de 1 % du montant de départ de la radioactivité est incorporé dans les protéines nouvellement synthétisées. Après l’enrichissement de la protéine par immunoprécipitation de la cible, l’échantillon pour SDS-PAGE contient moins de 0,05 % du montant de départ de la radioactivité.
Bien que le 35S méthionine et la cystéine étiquetage mix est stabilisé, une décomposition, produisant des composés radioactifs volatils, se produira. Pour protéger le chercheur et l’appareil, certaines précautions doivent être prises. Le chercheur doit toujours obéir aux règles de sécurité de rayonnement local et peut porter un charbon masque, outre une blouse et des gants (doubles) de soins infirmiers. Flacons stocks avec 35S méthionine et la cystéine devraient toujours être ouvert dans une hotte aspirante ou sous un point d’aspiration locale. Taches de contamination connue de laboratoire sont centrifugeuses, pipettes, bains-marie, incubateurs et dispositifs trembleurs. La contamination de ces zones est réduite à l’aide de pointes de pipette avec un filtre à charbon actif, positif-seal microtubes à centrifuger (voir Table des matières), éponges aquarium charbon de bois dans l’eau bains, charbon filtre papiers collés dans les plats de chasse, renfort en charbon de bois dans le système d’aspiration et le placement des plats contenant des grains de charbon de bois dans des incubateurs ou des récipients de stockage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes Pulse-chase ont été essentiels pour développer la compréhension des scientifiques de protéine pliage dans les cellules intactes. Alors que nous avons tenté de fournir une méthode qui est aussi générale que possible, cette approche a le potentiel pour des variations presque infinies étudier les divers processus qui se produisent pendant le pliage, le transport et la vie des protéines à l’intérieur de la cellule.
Lors d’une poursuite de l’impulsion à l’aide de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient tous les membres du laboratoire Braakman, passés et présent, pour leurs discussions fructueuses et aident à développer les méthodes présentées dans cet article. Ce projet a été financé par le Conseil européen de la recherche au titre septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) N ° de l’Union européenne 235649 tant l’organisation pays-bas de la recherche scientifique (NWO) en vertu de l’ECHO-programme N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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