Summary

Analyse de repliement des protéines, des transports et dégradation dans les cellules vivantes par radioactifs Pulse Chase

Published: February 12, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour une méthode de chasse générale qui permet l’analyse cinétique de pliage, le transport et la dégradation des protéines qui doivent être suivies dans des cellules vivantes.

Abstract

Marquage radioactif pulse-chase est un outil puissant pour l’étude de la maturation conformationnelle, le transport vers leur localisation cellulaire fonctionnelle et la dégradation des protéines cibles dans des cellules vivantes. En utilisant les radiolabeling temps courts (impulsion) (< 30 min) et étroitement contrôlé fois chase, il est possible d’étiqueter seulement une petite fraction de la piscine de protéines totales et suivre son pliage. Lorsqu’il est combiné avec non-réducteurs/réduire l’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunoprécipitation avec des anticorps (conformation spécifique), processus de pliage peut être examiné en détail. Ce système a été utilisé pour analyser le repliement des protéines avec une énorme variation de propriétés telles que des protéines solubles, des protéines transmembranaires simples et multi-pass, fortement protéines N – et O-glycosylées et des protéines avec ou sans une vaste disulfure collage. Méthodes de chasse sont à la base des études cinétiques dans une gamme de fonctionnalités supplémentaires, notamment des co – et des modifications post-traductionnelles oligomérisation et polymérisation, essentiellement en permettant l’analyse d’une protéine de la naissance à la mort. Études de Pulse-chase sur le repliement des protéines sont complémentaires avec d’autres méthodes biochimiques et biophysiques pour l’étude des protéines in vitro en offrant une résolution temporelle accrue et des informations physiologiques. Les méthodes décrites dans cet article sont facilement adaptés pour étudier le repliement des presque toute protéine qui peut être exprimé dans les systèmes de mammifères ou des insectes-cellule.

Introduction

Le repliement des protéines de même relativement simple implique plusieurs différentes enzymes pliants, chaperons moléculaires et modifications covalentes1. Une reconstitution complète de ces processus in vitro est pratiquement impossible, étant donné le grand nombre de différents composants impliqués. Par conséquent, il est hautement souhaitable, pour étudier le repliement in vivo, dans des cellules vivantes des protéines. Techniques de chasse radioactifs s’avérer un outil puissant pour l’étude de la synthèse, pliage, transport et la dégradation des protéines dans leur environnement naturel.

Le métabolisme d’étiquetage de protéines au cours d’une brève impulsion avec 35S-labeled méthionine/cystéine, suivie d’une course-poursuite en l’absence d’un marqueur radioactif, permet un suivi spécifique d’une population de protéines nouvellement synthétisées dans le milieu cellulaire la plus large. Ensuite les protéines cibles peuvent être isolée par immunoprécipitation et analysés par SDS-PAGE ou autres techniques. Pour beaucoup de protéines, leur périple à travers la cellule est marquée par des modifications visibles sur gel SDS-PAGE. Par exemple, le transport des protéines glycosylées du réticulum endoplasmique (ER) à l’appareil de Golgi est souvent accompagné par des modifications de N-glycanes ou l’addition de O-glycanes2,3. Ces modifications provoquent des augmentations importantes dans la masse moléculaire apparente, qui peut être vu par les changements de mobilité en SDS-PAGE. Maturation peut également être marquée par des clivages protéolytiques, tels que le clivage du peptide signal ou l’enlèvement de pro-peptides, entraînant des changements dans la masse moléculaire apparente que l’on peut suivre facilement sur de gel SDS-PAGE4. La radioactivité a des avantages considérables sur des techniques comparables tels que les poursuites de cycloheximide, où elle empêche la synthèse de nouvelles protéines, comme les traitements plus longs sont toxiques pour les cellules et n’excluent pas la majorité des protéines âgées, équilibre de la analyse, que certaines protéines ont des demi-vies de jours. La comparaison des protéines sous les deux non réductrice et conditions réductrices permet l’analyse de formation de la liaison disulfure, une étape importante dans le pliage de nombreuses protéines sécrétoires4,5,6, 7.

Nous décrivons ici une méthode générale d’analyse de repliement des protéines et de transport dans les cellules intactes, en utilisant une approche radioactifs pulse-chase. Alors que nous avons visant à assurer l’application de la méthode détaillée que possible, le protocole a un potentiel presque illimité pour adaptabilité et permettra l’optimisation pour l’étude des protéines spécifiques de chaque lecteur.

Deux protocoles alternatifs pulse-chase, un pour les cellules adhérentes (étape 1.1 du protocole présenté ici) et l’autre pour les cellules en suspension (étape 1.2 du protocole présenté ici) sont fournis. Les conditions prévues ici suffisent visualiser une protéine exprimée avec moyen – à haut-niveau d’expression. Si le lecteur ne fonctionne pas avec les protéines mal exprimées ou diverses conditions après le traitement, comme plusieurs d’immunoprécipitation, il est nécessaire d’augmenter la taille du plat ou le nombre de cellules de façon appropriée.

Pour chase de suspension de pouls, les échantillons de chase prélevés à chaque instant sont tirées d’un seul tube de cellules. Les étapes de lavage après l’impulsion sont omises ; au lieu de cela, plus l’incorporation de 35S est empêchée par dilution avec un excès élevé de non étiqueté méthionine et la cystéine.

Les protocoles présentés utilisent radioactifs 35S-labeled cystéine et méthionine pour suivre le processus de repliement des protéines cellulaires. Toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l’aide de mesures de protection appropriées afin de minimiser toute exposition de l’opérateur et l’environnement aux rayonnements radioactifs et être effectuée dans un laboratoire désigné. Comme le pulse-chase étiquetage technique est relativement inefficace en temps de pulsation courte (< 15 min), moins de 1 % du montant de départ de la radioactivité est incorporé dans les protéines nouvellement synthétisées. Après l’enrichissement de la protéine par immunoprécipitation de la cible, l’échantillon pour SDS-PAGE contient moins de 0,05 % du montant de départ de la radioactivité.

Bien que le 35S méthionine et la cystéine étiquetage mix est stabilisé, une décomposition, produisant des composés radioactifs volatils, se produira. Pour protéger le chercheur et l’appareil, certaines précautions doivent être prises. Le chercheur doit toujours obéir aux règles de sécurité de rayonnement local et peut porter un charbon masque, outre une blouse et des gants (doubles) de soins infirmiers. Flacons stocks avec 35S méthionine et la cystéine devraient toujours être ouvert dans une hotte aspirante ou sous un point d’aspiration locale. Taches de contamination connue de laboratoire sont centrifugeuses, pipettes, bains-marie, incubateurs et dispositifs trembleurs. La contamination de ces zones est réduite à l’aide de pointes de pipette avec un filtre à charbon actif, positif-seal microtubes à centrifuger (voir Table des matières), éponges aquarium charbon de bois dans l’eau bains, charbon filtre papiers collés dans les plats de chasse, renfort en charbon de bois dans le système d’aspiration et le placement des plats contenant des grains de charbon de bois dans des incubateurs ou des récipients de stockage.

Protocol

Tous les réactifs radioactifs et les procédures ont été traitées conformément aux règlements et les règles locales de rayonnement de l’Université d’Utrecht. 1. pulse Chase Pulse-Chase pour les cellules adhérentesNOTE : Les volumes donnés ici sont basées sur les boîtes de culture cellulaire 60 mm. Pour 35 mm ou 100 mm plats, multiplier les volumes de 1/2 ou 2, respectivement. Ce protocole utilise un temps d’impulsion des temps 10 min et chase …

Representative Results

Le repliement et la sécrétion de la gp120 du VIH-1 d’un chase impulsion adhérentes est illustré à la Figure 2. Le gel non réductrice (NR de cellules dans la figure) montre le repliement oxydatif de gp120. Immédiatement après la pulsion d’étiquetage de gp120 5 min (0 min chase) apparaît comme une bande diffuse plus élevée dans le gel, et à mesure que progresse la chase, la bande migre vers le bas le gel grâce à encore plus diffus pliage inte…

Discussion

Les méthodes Pulse-chase ont été essentiels pour développer la compréhension des scientifiques de protéine pliage dans les cellules intactes. Alors que nous avons tenté de fournir une méthode qui est aussi générale que possible, cette approche a le potentiel pour des variations presque infinies étudier les divers processus qui se produisent pendant le pliage, le transport et la vie des protéines à l’intérieur de la cellule.

Lors d’une poursuite de l’impulsion à l’aide de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient tous les membres du laboratoire Braakman, passés et présent, pour leurs discussions fructueuses et aident à développer les méthodes présentées dans cet article. Ce projet a été financé par le Conseil européen de la recherche au titre septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) N ° de l’Union européenne 235649 tant l’organisation pays-bas de la recherche scientifique (NWO) en vertu de l’ECHO-programme N ° 711.012.008.

Materials

1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20×25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
HEPES Sigma H4034 Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

References

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Cite This Article
McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

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