Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase
Summary
Her beskriver vi en protokoll for en generell puls-jage metode som tillater kinetisk analyse av folding, transport- og nedbrytning av proteiner som skal følges i levende celler.
Abstract
Radioaktivt puls-jage merking er et kraftig verktøy for å studere conformational modning, transport til deres funksjonelle mobilnettet plassering og nedbrytning av målet proteiner i levende celler. Med kort (puls) radiolabeling ganger (< 30 min) og strengt kontrollert chase ganger, er det mulig å merke bare en liten brøkdel av totale protein og følge sin folding. Kombinert med nonreducing/redusere SDS-polyakrylamid gel gelelektroforese (SDS-side) og immunoprecipitation med (konformasjon-spesifikk) antistoffer, kan folding prosesser undersøkes i stor detalj. Dette systemet har blitt brukt til å analysere folding av proteiner med en stor variasjon i egenskaper som løselig proteiner, enkelt og multi-pass transmembrane protein, tungt N – og O-glycosylated proteiner og proteiner med og uten omfattende disulfide binding. Puls-jage metoder er grunnlaget for kinetic studier til en rekke tilleggsfunksjoner, inkludert co og posttranslational modifikasjoner, oligomerization og polymerisasjon, i hovedsak slik at analyse av et protein fra fødselen til døden. Puls-jage studier protein folding er komplementære andre biokjemiske og Biofysiske metoder for å studere proteiner i vitro økt midlertidig løsning og fysiologiske informasjon. Metodene som beskrives i dette papiret er tilpasset lett for å studere folding av nesten alle protein som kan uttrykkes i pattedyr eller insekt-cellen.
Introduction
Folding av selv relativt enkel proteiner involverer mange ulike folding enzymer, molekylær chaperones og kovalente modifikasjoner1. En komplett rekonstituering av disse prosessene i vitro er praktisk talt umulig, gitt det store antallet ulike komponenter involvert. Det er svært ønskelig, derfor, å studere protein folding i vivoi live celler. Radioaktivt puls-jage teknikker være et kraftig verktøy for å studere syntese, folding, transport og nedbrytning av proteiner i sitt naturlige miljø.
Den metabolske merking av proteiner under en kort puls med 35S-merket metionin/cystein, etterfulgt av en jakt i fravær av en radioaktiv etikett, tillater spesifikk sporing av innbyggere nylig syntetisert proteiner i bredere mobilnettet miljøet. Deretter målet proteiner kan være isolert via immunoprecipitation og analysert via SDS-siden eller andre teknikker. For mange proteiner, er sin reise gjennom cellen preget av endringer som er synlige på SDS side gel. For eksempel er transport av glycosylated proteiner fra det endoplasmatiske retikulum (ER) til Golgi komplekset ofte ledsaget av modifikasjoner av N-koblede glykaner eller tillegg av O-koblede glykaner2,3. Disse endringene føre til store økninger i tilsynelatende molekylær masse, som kan sees av mobilitet endringer i SDS-side. Modning kan også merkes av proteolytisk cleavages, som signal-peptid spalting eller fjerning av pro-peptider, noe som resulterer i endringer i tilsynelatende molekylær massen som kan følges lett på SDS-side gel4. Radioaktivitet har betydelige fordeler fremfor sammenlignbare teknikker som gapestokk jager, hvor romanen proteinsyntese er forhindret, lengre behandlinger er giftig for celler og utelukker ikke flertallet av eldre, stabil proteiner fra den analyse, som noen proteiner har dager. Sammenligning av proteiner under både nonreducing og redusere forholdene tillater analyse av disulfide obligasjon formasjonen, et viktig skritt i folding av mange sekretoriske proteiner4,5,6, 7.
Her beskriver vi en generell metode for analyse av proteinfolding og transport i intakt celler, med en radioaktiv puls-jage tilnærming. Mens å gi metoden som detaljert som mulig, protokollen har en nesten ubegrensede muligheter for tilpasning og vil tillate optimalisering å studere hver leserens spesifikke proteiner.
To alternative puls-jage protokoller, én for tilhenger celler (trinn 1.1 av protokollen presenteres her) og én for suspensjon celler (trinn 1.2 av protokollen presenteres her) er gitt. Betingelsene gis her er nok å visualisere et protein uttrykt med middels til høy-uttrykk nivåer. Hvis leseren arbeider med dårlig uttrykt proteiner eller ulike posttreatment forhold, som flere immunoprecipitations, er det nødvendig å forstørre parabolen eller celle nummer riktig.
For suspensjon puls chase, er chase prøver tatt på hvert tidspunkt alle tatt fra en enkelt rør av celler. Vask trinnene etter pulsen utelates; i stedet ytterligere hindres innlemmelse av 35S av fortynning med en høy overskudd av umerkede metionin og cystein.
Presentert protokollene bruk radioaktivt 35S-merket cystein og metionin for å følge mobilnettet protein-folding prosesser. Alle operasjoner med radioaktive reagenser bør utføres med passende forholdsregler å minimere eventuelle eksponering av operatøren og miljø for radioaktiv stråling og utføres i et utpekt laboratorium. Som puls-jakten merking teknikk er relativt ineffektiv kort puls ganger (< 15 min), mindre enn 1% av startbeløpet for radioaktivitet er innarbeidet i de nylig syntetisert proteinene. Etter anriking av målet protein via immunoprecipitation inneholder utvalget for SDS siden mindre enn 0.05% av startbeløpet for radioaktivitet.
Selv om de 35S metionin og cystein merking blanding har stabilisert seg, vil noen nedbryting, gir flyktige radioaktivt forbindelser, skje. For å beskytte forskeren og apparatet, bør forholdsregler tas. Forskeren må alltid følge lokale stråling sikkerhetsreglene og kan slites trekull sykepleie maske, foruten en labfrakk og (doble) hansker. Lager ampuller med 35S metionin og cystein bør alltid åpnes i avtrekksvifte, eller under en lokal aspirasjon punkt. Kjente laboratorium forurensning flekker er sentrifuger, Pipetter, vann bad, inkubatorer og shakers. Forurensning av disse områdene reduseres ved hjelp av pipette-spisser med filtere trekull, positiv-seglet microcentrifuge rør (se Tabell for materiale), akvariet trekull svamper vann bad, trekull filter Papers limt i puls-jage retter, trekull vakt i aspirasjon systemet, og plasseringen av retter som inneholder trekull korn i inkubatorer og lagercontainere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puls-jage metoder har vært avgjørende for utvikling av forskernes forståelse av protein folding i intakt celler. Mens vi har forsøkt å gi en metode som er generelt som mulig, har dette potensial for nesten ubegrensede varianter å studere ulike prosesser som oppstår under den folding, transport, og livet til proteiner i cellen.
Når du utfører en puls jage bruke tilhenger celler i retter, er det viktig å behandle hver rett det samme så mye som mulig, som en egen rett brukes for hvert …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker alle medlemmer av Braakman lab, forbi og presentert for diskusjonene fruktbart og å utvikle metodene i denne artikkelen. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra både europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 og Nederland organisasjonen av vitenskapelig forskning (NWO) under ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
