استخدام البرزي caudatum براميسيوم كوسيلة للأمراض المنقولة بالأغذية في "اليرقات الزرد"
Summary
أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج حيوانات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للاستعمار الميكروبي والمرضية. ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا caudatum براميسيوم كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في اليرقات الزرد. كوداتوم P. الزاجرة البكتيريا بسهولة والحصول على تناول الزرد اليرقات من خلال سلوك الضحية الطبيعية.
Abstract
نظراً لشفافيتها والصوبه الوراثية، وسهولة الصيانة، أصبحت الزرد (دانيو rerio) نموذج الفقارية المستخدمة على نطاق واسع للأمراض المعدية. وبطبيعة الحال تفترس اليرقات الزرد بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم. ويصف هذا البروتوكول باستخدام كاوداتوم P. كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الأغذية في الزرد اليرقات. كوداتوم P. استيعاب مجموعة واسعة من البكتيريا والخلايا البكتيرية تظل قابلة للاستمرار لعدة ساعات. ثم تفترس الزرد P. caudatumوهو الإفراج عن الحمولة البكتيرية في المعي عند الهضم السيارة براميسيوم والبكتيريا استعمار الأمعاء. البروتوكول يتضمن وصفاً مفصلاً لصيانة باراميسيا، تحميل مع البكتيريا، تحديد تدهور البكتيرية والجرعة، وكذلك العدوى من الزرد بالتغذية مع باراميسيا. وميزة استخدام هذا الأسلوب من العدوى المنقولة عن طريق الأغذية هو أنه عن كثب يحاكي طريقة العدوى في الأمراض التي تصيب البشر، ويؤدي إلى استعمار أكثر قوة بالمقارنة مع البروتوكولات الغمر، ويتيح دراسة طائفة واسعة من العوامل الممرضة. يمكن استخدام العدوى المنقولة عن طريق الأغذية في النموذج الزرد للتحقيق في التعبير الجيني البكتيرية داخل المضيف، والتفاعلات المضيف الممرض، والسمات المميزة للقدرة الإمراضية بما في ذلك عبء البكتيرية والتعريب ونشرها والاعتلال.
Introduction
حصة الزرد شكلياً ووظيفيا حفظت الميزات مع الثدييات، بما في ذلك الأنساب جرانولوسيتيك (مثلاً، العَدلات) والوحيدات/بلعم-مثل الخلايا والمستقبلات الشبيهة بعدد القتلى، السيتوكينات الموالية التحريضية والببتيدات المضادة للميكروبات1 . الأمعاء في الزرد تماما توضع في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية)، ويظهر حفظ الخصائص المورفولوجية والوظيفية مع الجهاز الهضمي الثدييات، مثل تنظيم النسخي مصانة في الخلايا الظهارية المعوية 2-وهذا يجعل من الزرد نموذجا رائعا لاستعمار الجراثيم المعوية والمرضية. ودرست مجموعة واسعة من الجراثيم المعوية في النموذج الزرد، بما في ذلك enterohemorrhagic الإشريكيّة القولونية3،4، الكوليرا5،6من انتيريكا السالمونيلا، الزرد الحجمية7،8، ودور البروبيوتيك في حصانة المعوية9. هي ميزة النموذج الزرد هو المستعمر بالعديد من الميكروبات دون تعطيل الحجمية الذاتية، مما يسمح التحقيق في سلوك الميكروبية في سياق المختلطة السكان الميكروبية3، 6. حاليا، معظم النماذج الزرد الاستعمار المعدية المعوية، والمرض تعتمد على الإدارة للميكروبات بغمر حمام، حيث هي المحتضنة الزرد في تعليق بكتيرية لمقدار معين من الوقت10. ومع ذلك، هذا يجعل من الصعب تحديد الجرعة الدقيقة من البكتيريا التي تديرها، ويؤدي إلى استعمار محدودة مع بعض الميكروبات، لا سيما مع البكتيريا غير ممرضة. بدلاً من ذلك، تعليق بكتيرية ويدار بالصيد عن طريق الفم تزقيمية مدتها11، ولكن هذا من الناحية الفنية صعبة ومحدودة لليرقات كبار السن والأسماك الكبار.
ويصف هذا البروتوكول استخدام بروتوزوا اونيسلولر caudatum براميسيوم كوسيلة لإيصال المنقولة عن طريق الأغذية من الميكروبات إلى الجهاز الهضمي ليرقات الزرد. هي سهلة ورخيصة للحفاظ على باراميسيا وقادرون على تغذية في مجموعة متنوعة واسعة من الجراثيم، بما في ذلك الطحالب والفطريات، والبكتيريا، وأنها تستوعب من خلال13،،من12أخدود شفوي عضو14. بمجرد استيعابه، البكتيريا وتعقد في فاكوليس، التي أسيديفي في نهاية المطاف، ومحتويات المتدهورة على مدى زمني لعدة ساعات15. الزرد اليرقات التقاط باراميسيا كفريسة الطبيعية قريبا بعد الفقس، حوالي 3-4 إدارة الشرطة الاتحادية تبعاً لدرجة الحرارة16، ويستغرق منهم بكفاءة عالية. عملية التقاط فريسة يأخذ في المتوسط 1.2 s من الكشف للقبض على17، ويتم بسرعة هضمها باراميسيا تم التقاطها في المعي الزرد، أن تطلق البكتيريا قادرة على البقاء المدخلة في الأمعاء3. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام باراميسيا كوسيلة سريعة وسهلة لتقديم جرعة عالية ومتسقة من البكتيريا في الجهاز الهضمي من الزرد. يمكن أما أن تتحول البكتيريا تم تسليمها للتعبير عن بروتين فلورية، مثل مشري كما هو موضح هنا، أو، في حالة البكتيريا وراثيا مستعصية على الحل، ويمكن أن تكون ملطخة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح للتصور داخل الجهاز الهضمي.
يصف هذا البروتوكول تقديم تنقلها الأغذية انتيروباثوجينيك كولاي (انتيروهيمورهاجيك كولاي [الإشريكيّة] وملتصقة الغازية كولاي [أيك]), وموفر انتيريكا السالمونيلا تيفيموريوم. الممرضة كولاي و تيفيموريوم س المرسلة عن طريق ال18،البراز طريق الفم19، ويمكن أن تكون مكتسبة عن طريق تلوث الأغذية، مثل اللحوم والخضروات ومنتجات الألبان. استخدام كوداتوم P. كوسيلة، كولاي و تيفيموريوم س. استعمار بنجاح اليرقات الزرد ضمن 30 – 60 دقيقة لاحتضان المشارك مع السيارة براميسيوم. يقع عبء البكتيرية تحقق قوية بما يكفي لتصور الاستعمار وتحديد العبء بطلاء هوموجيناتيس الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الأساسية الموصوفة هنا تم الأمثل للممرضة كولاي، وقد تم تكييف بنجاح للأنواع البكتيرية الأخرى، بما في ذلك انتيريكا السالمونيلا و الكوليرا. لبعض الأنواع التي لم تستعمر الأمعاء الزرد بعد غمر حمام، بما في ذلك بعض سلالات السالمونيلا انتيريكا وبعض اللاهوائيات، العدوى المنقولة عن طريق الأغذية كما هو موضح هنا يمكن بنجاح إنشاء الاستعمار. ميكروجافاجي، الذي يستخدم أيضا إنشاء ارتفاع أعباء البكتيرية في الأمعاء اليرقات، بالمقارنة مع العدوى المنقولة عن طريق الأغذية من الناحية التقنية أقل تحديا ويتطلب معدات متخصصة أقل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل المعلمات حرجة للأنواع البكتيرية وسلالات لاستخدامها. وتشمل هذه العوامل البكتيرية وبراميسيوم الكثافة للخطوة ثقافة المشارك البكتيريا-براميسيوم: إذا كانت أرقام البكتيرية داخل باراميسيا منخفضة، هذا يمكن تحسينها من خلال زيادة كثافة البكتيرية في الخطوة ثقافة المشارك. بعض الأنواع البكتيرية قد يسبب الضرر للمضيف براميسيوم وينبغي تقييم هذا الفحص المجهري.
عامل مهم آخر في هذا البروتوكول استيلاء فريسة الزرد. ويستند على افتراض أن كل التقاط فريسة الإضراب النتائج في ابتلاع براميسيوم واحد معدل الضحية كما هو موضح هنا. وتستخدم كثافات عالية من باراميسيا كل الأسماك في البروتوكول لضمان ارتفاع معدلات الضحية. ومع ذلك، التقاط فريسة اعتماداً على كثافة باراميسيا في النظام، وفي الثقافات براميسيوم مخفف جداً، قد تكون الضحية معدلات منخفضة تصل إلى 13 – 15 باراميسيا كل ساعة21،22. حد هو أن معدلات التقاط الفريسة أيضا تعتمد بشدة على ظروف الإضاءة وفي الظلام، ومعدلات التقاط 80% أقل مما في ضوء الظروف21 ، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند إعداد تجارب. إذا كان مرات التعرض فريسة لتوسيع نطاق لتحسين الاستعمار، قد النظر للتعرض الثانوي للبكتيريا عن طريق البراز. لا يكاد هذا التعرض الظروف المذكورة أعلاه – ح 2 من التعرض فريسة –، منذ وقت مرور القناة الهضمية من البكتيريا أكثر من 1 ح وتركيز البكتيريا في السيارة أعلى بكثير مما في البراز. ومع ذلك، إذا كان إلى حد كبير هو زيادة وقت التعرض فريسة، هذا قد تصبح عاملاً هاما.
ضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في هذا البروتوكول، بما في ذلك استعمار الزرد عقب التغذية مع باراميسيا المحتوية على غير ممرضة كولاي MG1655. إذا مقارنة السلالات البكتيرية متعددة لقدرتها على استعمار البلد المضيف الزرد، فمن المهم اختبار ما إذا كان نصف العمر بهم داخل باراميسيا قابل للمقارنة. الطفرات البكتيرية، بما في ذلك المساس بسلامة جدار الخلية أو حمض الاستشعار، قد يعرض للخطر الاستقرار البكتيرية داخل باراميسيا. في مثل هذه الحالات، والتغذية الزرد قد يتعين تعديلها لمراعاة الاختلافات في الجرعة.
يمكن استخدام البروتوكول هو موضح هنا للتحقيق الاستعمار الجرثومي ونتائجها، بما في ذلك التصوير الاستعمار الجرثومي من الزرد كما هو موضح أعلاه، فضلا عن تحديد زيمبابوي الواحدة الزرد من الأنسجة هوموجيناتي3، أو التحقيق المرتبطة بالإصابة بالأمراض والوفيات. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم السلالات البكتيرية معربا عن البروتينات الفلورية مثل مشري أو البروتين الأحمر نيون (RFP) للتصور البكتيرية،. سيسمح هذا التصور من تزايد السكان البكتيرية. إذا لم يكن وراثيا أصعب السلالة البكتيرية أو يمنع استخدام تعبير البروتينات الفلورية لأسباب أخرى، قد ملطخة البكتيريا بصبغة فلورسنت، مثل وزير الخارجية 4-64FX، السابقة الثقافة شارك مع باراميسيا. عند استخدام بروتوكول الموصوفة هنا، ثقافة المشارك مع باراميسيا عدم تقليل سطوع الصبغ والبكتيريا ملطخة مرئية بوضوح في الأمعاء الزرد. ومع ذلك، سوف المخفف الصبغة على مر الزمن ينبغي أن يحدث انتشار البكتيرية كبيرة داخل البلد المضيف الزرد. وفي كلتا الحالتين، الأحمر نيون البكتيريا الأفضل على البكتيريا الخضراء-فلوري، منذ أوتوفلوريسسينسي الأنسجة يمكن أن تكون أعلى في الأخضر في القناة الحمراء.
وقد وجد أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها للهوائي والأنواع البكتيرية ميكروايروفيليك. قد يكون من الممكن لتكييفه لتغذية الجراثيم والأنواع الفطرية، على الرغم من أن هذا لا يزال يمكن اختباره تجريبيا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء الفريق كراتشلير لقراءة نقدية وتعليقات على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة “نجم نظم حزب التحرير”، في بسرك، والمعاهد الوطنية للصحة (R01AI132354).
Materials
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O’Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O’Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
